论文摘要
1999年6月，天津医科大学微生物教研室从急性呼吸道感染致死的灵长类动物狨猴肺组织中分离出一株高血凝效价病毒，经过一系列的研究证实为一株副粘病毒，即副粘病毒天津株。经电镜观察具有典型的副粘病毒特征。用交叉血凝抑制试验对分离毒株进行鉴定，扩增HN基因测序后，用生物信息学方法与多种核酸序列进行比较，发现该毒株与仙台病毒（SeV）特征最为接近。进一步研究发现该动物中心的工作人员都有此病毒的抗体，且在正常人群（献血员）中抗体反应也是阳性，阳性率高达46％（14／40），提示此病原体与人类有密切的关系，可能是一株人和绒猴共患的呼吸道病毒。我们现在已经完成了对该株病毒的全基因组测序，通过全基因组系统进化树分析，其与SeV同源性较高，也证明了该株病毒很可能为SeV一个新的基因型。为进一步研究该毒株的生物学特性及致病机制，本研究构建了副粘病毒天津株包膜糖蛋白HN膜外区三个部分及整个M基因的原核表达质粒pET-28a-HN1、pET-28a-HN2、pET-28a-HN3及pMal-M，诱导表达、纯化了重组蛋白HNl（aa61-aa260）、HN2（aa253-aa452）、HN3（aa376-aa575）和MBP-M，并对其生物学和免疫学活性进行了初步研究。我们提取病毒RNA逆转录为cDNA。根据前期研究全基因组测序中的HN、M的基因序列，设计并合成引物，以该株病毒的cDNA为模板扩增目的片段，双酶切、纯化回收含粘末端的目的片段和空质粒，在T4 DNA连接酶作用下连接、转化克隆菌E．coli TOP10。经双酶切、PCR和基因测序鉴定筛选构建正确的目的基因，转化表达菌E．coli BL21，IPTG诱导表达。pET-28a-HN1、pET-28a-HN2和pET-28a-HN3所选用的载体质粒带有6×His标签，用Ni金属螯合柱进行回收，而pMal-M表达的蛋白带有MBP融合蛋白，用Amylose resin回收得到纯化的蛋白。用超速离心纯化的病毒和纯化表达蛋白分别制备PcAb，利用ELISA、Dot Blot及Western Blot等方法对表达蛋白进行免疫学鉴定。通过血凝试验和血凝抑制试验对副粘病毒天津株HN1、HN2和HN3蛋白的血凝功能及重组蛋白多克隆抗体的血凝抑制功能进行了初步研究。结果显示：HN1、HN2和HN3表现出来的天然抗原性明显不同，抗原性强弱依次为HN2＞HN3＞HN1；M蛋白的ELISA和Dot Blot方法鉴定结果也为阳性。而HN3的血凝活性明显强于HN蛋白的其他部位，其次为HN2蛋白，HN1几乎没有血凝功能。另外，利用ELISA方法对副粘病毒天津株HN1、HN2和HN3蛋白与甲型、乙型流感病毒的WHO标准血清和天津CDC获得的阳性血清的交叉免疫情况进行了研究，结果显示：HN1、HN2和HN3三种蛋白与这些血清存在交叉免疫反应。综上，本研究成功的构建了HN1、HN2、HN3和M的原核重组表达质粒pET-28a-HN2、pET-28a-HN3及pMa1-M，经诱导、表达、纯化得到了重组蛋白HN1、HN2、HN3和M，并对其进行了免疫学和生物学的初步鉴定，为进一步研究副粘病毒天津株的致病机制，制备单克隆抗体和建立该毒株特异的检测方法奠定了基础。
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标签：副粘病毒天津株论文; 和蛋白论文; 基因克隆构建论文; 诱导表达论文; 免疫学和生物学活性鉴定论文;