论文摘要
鱼类是人类食物中高不饱和脂肪酸（HUFA）的主要来源,HUFA对促进心脑血管健康、提高免疫机能、神经发育以及抗炎症等方面都是有益的。鱼类的HUFA的合成过程包括C18PUFA的去饱和和延长过程,其中A6-脂肪酸去饱和酶和脂肪酸延长酶（Elov15）是HUFA合成过程中的关键酶。建鲤（Cyprinus carpio var Jian）属鲤鱼一种,是淡水、杂食性、底栖且能够快速生长的鱼类,是以特定的荷包红鲤和沅江鲤为亲本,采用综合育种工艺,经六代定向选育而成的良种。鲤鱼的染色体数目是大多数鲤科鱼类的两倍,在进化上被认为是典型的四倍化模式生物,因此推断,鲤鱼可能具有更多的△6-脂肪酸去饱和酶和脂肪酸延长酶（Elov15）,拥有比其它鱼类更复杂的HUFA合成调控机理。本实验首次克隆得到建鲤两种△6-脂肪酸去饱和酶和两种脂肪酸延长酶（Elovl5）的cDNA序列,并对基因结构和表达时序特征进行分析,首次获得建鲤△6-脂肪酸去饱和酶和脂肪酸延长酶（Elov15）的基因组序列,分析其结构特点,并查找与建鲤生长相关的SNP位点,为开展建鲤的分子标记辅助育种奠定基础。通过调控鲤鱼的饲料中的必需脂肪酸（EFA）和水温比较系统地研究鲤鱼生物合成HUFA的途径与机理,试图从营养学、环境生态学的角度及分子水平找到一种合理的调控手段,为生产富含高不饱和脂肪酸的鲤鱼提供理论依据,研究结果将有助于揭示多倍体鱼类的HUFA合成调控的分子机制。1.建鲤两种脂肪酸去饱和酶（△6-Fad）基因的克隆与序列分析本研究克隆了建鲤的△6-脂肪酸去饱和酶的cDNA全长序列。利用RT-PCR和RACE技术获得建鲤2种△6-脂肪酸去饱和酶,即△6-Fad-a和△6-Fad-b的全长cDNA序列。结果显示,A6-Fad-a基因的cDNA总长为1966bp,开放阅读框为1335bp,编码444个氨基酸;Δ6-Fad-b基因的cDNA总长为1931bp,开放阅读框为1335bp,编码444个氨基酸。△6-Fad-a和△6-Fad-b基因都包括N-末端细胞色素b5结构域、3个富含组氨酸的结构域和2个推测的跨膜区,具有典型的A6-脂肪酸去饱和酶结构特点;氨基酸同源性分析显示建鲤的△6-Fad-a和△6-Fad-b与斑马鱼的△5/△6△6-Fad的相似性为90%以上,与军曹鱼、虹鳟、大菱鲆的同源性在65%以上,而与人类的△6-Fad的相识性要高于与A5-fad的相似性。系统树分析发现,△6-Fad-a和A6-Fad-b与其他鱼类的△6-脂肪酸去饱和酶基因聚为一类。利用PCR技术扩增获得建鲤的△6-Fad-a和A6-Fad-b基因的部分基因组序列,△6-Fad-a和A6-Fad-b基因的DNA序列都包括13外显子和12个内含子,其中编码区外显子为12个,但是序列长度不同,其中△6-Fad-a的序列长11533bp;而△6-Fad-b的序列长13227bp。通过与已经获得的A6-Fad-a和△6-Fad-b基因的cDNA进行比对分析,发现第1个外显子、第2个外显子的一部分和第13个外显子的一部分是非编码区。△6-Fad-a和△6-Fad-b基因的编码区的外显子长度都一致,且相似度也较高,都大于87%;而2个非编码区的序列长度△6-Fad-a大于A6-Fad-b,相似度较低分别为69.1%和32.6%。内含子序列长度不一致,其相似度差异也较大。经过对内含子序列分析发现,两种基因的所有的内含子两侧具有5’GT和3’AG的二核苷酸结构,即都属于GT-AG内含子。在△6-Fad-a和△6-Fad-b基因的内含子区域均发现微卫星序列。这为深入研究△6-Fad-a和△6-Fad-b基因结构和功能打下了基础。2.建鲤两种脂肪酸延长酶（Elolv5）基因的克隆与序列分析本研究克隆了建鲤的脂肪酸延长酶的cDNA全长序列。利用RT-PCR和RACE技术获得建鲤2种脂肪酸延长酶（Elolv5）,即Elovl5-a和Elovl5-b的全长cDNA序列。结果显示,Elovl5-a基因的cDNA总长为1225bp,开放阅读框为876bp,编码291个氨基酸:Elovl5-b基因的cDNA总长为1167bp,开放阅读框为876bp,编码291个氨基酸。A6-Fad-a和△6-Fad-a基因都包括C-末端内质网停留信号（K、R）、1个氧化还原中心组氨酸簇（HXXHH）,4个推测的跨膜区（KXXEXXDT、QXXFLHXYHH、NXXXHXXMYXYY、TXXQXXQ）,它们的氨基酸组成及其位置在不同脊椎动物中高度保守,具有典型的脂肪酸延长酶结构特点:氨基酸同源性分析显示其中建鲤的EL05-a与EL05-b与斑马鱼的相似性为90%以上,与军曹鱼、虹鳟、大西洋鲑鱼、大菱鲆、尼罗罗非鱼和人的同源性分别为71.9%以上。系统树分析发现,Elovl5-a和Elovl5-b与其他鱼类的脂肪酸延长酶（Elolv5）基因聚为一类。利用PCR技术扩增获得建鲤的Elovl5-a和Elovl5-b基因的部分基因组序列,Elovl5-a和Elovl5-b基因的DNA序列都包括8外显子和7个内含子,其中编码区外显子为7个,但是序列长度不同。通过与已经获得的Elovl5-a和Elovl5-b基因的cDNA进行比对分析,发现第1个外显子、第2个外显子的一部分和第8个外显子的一部分是非编码区。Elovl5-a和Elovl5-b基因的编码区的外显子长度都一致,且相似度也较高,都大于90.40%;而2个非编码区的外显子的序列的相似度较低分别为80.29%和58.26%。内含子序列长度不一致,其相似度差异也较大。经过对内含子序列分析发现,两种基因的所有的内含子两侧具有5’GT和3’AG的二核苷酸结构,即都属于GT-AG内含子。在Elovl5-a和Elovl5-b基因的内含子区域均发现微卫星序列。这为深入研究Elovl5-a和Elovl5-b基因结构和功能打下了基础。3.建鲤A6-Fad和Elovl5基因的时空表达及与脂肪酸组成相关性分析本研究通过荧光定量PCR检测了 △6-Fad-a和△6-Fad-b基因以及Elovl5-a和Elovl5-b基因在建鲤受精卵、仔鱼、幼鱼和成鱼的时空表达。研究发现,建鲤的两种△6-脂肪酸去饱和酶基因和脂肪酸延长酶（Elovl5）在组织中表达水平存在差异,无论在幼鱼还是在成鱼阶段,△6-Fad-a基因在肝脏和肠道的表达量高于△6-Fad-b基因,而△6-Fad-b基因在脑部和肝脏中表达量最高;建鲤Elovl5-a基因在肝脏和肠内表达较高,而Elovl5-b基因在脑部的表达量最高;建鲤的△6-脂肪酸去饱和酶基因和脂肪酸延长酶（Elovl5）基因在受精卵、仔鱼、幼鱼阶段出现明显的变化,在鱼苗的20d时基本上达到最高的表达,△6-Fad-a和Elovl5-a基因表达水平分别高于△6-Fad-b 和Elovl5-b基因。本研究发现建鲤在胚胎发育阶段和鱼苗孵出阶段其△6-Fad和Elovl5基因发生明显的变化,而且出现明显的升高的趋势,同时发现建鲤胚胎阶段和鱼苗阶段的脂肪酸组成也发生相应变化,在建鲤胚胎发育的48h,其机体脂肪酸总产物和DHA的呈现下降的趋势,而后出现上升和波动;建鲤在胚胎阶段和鱼苗阶段的脂肪酸组成变化和△6-Fad和Elovl5基因的变化相关系数发现,△6-脂肪酸去饱和酶基因与建鲤的脂肪酸的生成总产物和DHA的相关系数比较高;而建鲤的Elovl5基因主要受到建鲤的脂肪酸的C18底物的影响。且△6-Fad-a和△6-Fad-b以及Elovl5-a和Elovl5-b之间可能存在着功能差异。这为进一步研究建鲤HUFA的合成途径及调控机理奠定了基础。4.建鲤△6-Fad、Elovl5基因调控的研究△6-脂肪酸去饱和酶和Elovl5脂肪酸延长酶是高不饱和脂肪酸（HUFA）合成的限速酶,不同种类的鱼类转化合成HUFA的能力也不同。△6-脂肪酸去饱和酶和Elovl5脂肪酸延长酶受到营养和水温的影响。本研究通过调控饲料中脂肪酸的水平,研究建鲤HUFA的合成与A6-脂肪酸去饱和酶和Elovl5脂肪酸延长酶基因表达之间的关系。建鲤幼鱼饲喂含有不同脂肪酸的饲料（D1:鱼油含有HUFA;D2:玉米油和D3:亚麻籽油,其亚油酸和亚麻酸的含量分别为52.30%和0.61%,18.38%和45.46%）六周。其生长性能指标无明显差异（P>0.05）;通过比较试验结束时建鲤肌肉中的脂肪酸的含量发现,饲喂D2的肌肉中的AA含量显著高于D3组（P<0.05）,而EPA,DPA和DHA的含量显著低于D3和D1组（P<0.05）。在D2和D3组中的建鲤肝脏中其△6-Fad-a和Elovl5-a基因的表达量显著高于Dl组（P<0.05）,但是A6-Fad-b和Elovl5-b基因表达受饲料脂肪酸的影响较小。结论:建鲤能够利用亚油酸和亚麻酸转化为HUFA,A6-Fad-a和Elovl5-a基因主要参与建鲤机体HUFA的合成。本实验研究了建鲤的两种△6-脂肪酸去饱和酶和两种脂肪酸延长酶（Elovl5）基因在高温和低温应激状态下的变化模式,研究发现,建鲤的仔鱼在高温（32℃C）应激96h,△6-Fad-a基因从12h到48h出现明显的升高,而随后出现明显下降的趋势,而△6-Fad-b在高温和低温状态下,变化都不明显。而Elovl5-a和Elovl5-b基因在高温和低温环境中都发生明显的变化趋势。建鲤的两种△6-脂肪酸去饱和酶和两种脂肪酸延长酶（Elovl5）分别在肝脏、脑和肠道内参与调控温度应激时存在明显的差异;在低温状态下,A6-Fad-a基因在肝脏中的第4d表达水平最高,而在脑部和肠道中是在第7d的表达量最高;另外,A6-Fad-b基因在肝脏中的变化不明显,而在脑和肠道中呈现明显的变化趋势。同样,Elovl5-a基因在肝脏、脑和肠道中在温度应激状态下,基因的表达量也存在明显的时序变化差异:Elovl5-b基因在肝脏和脑部变化不明显,而在肠道中呈现明显的变化趋势。两种△6-脂肪酸去饱和酶和两种脂肪酸延长酶（Elovl5）基因在营养调控和温度应激状态下在不同的器官中可能存在不同的生物学机能。5.建鲤A6-Fad和Elovl5部分片段SNP多态性与生长性状相关性分析高不饱和脂肪酸（HUFA）具有促进心脑血管健康、提高免疫机能、神经发育以及抗炎症等方面功能。A6-脂肪酸去饱和酶（△6-Fad）和脂肪酸延长酶（Elovl5）是鱼类自身合成HUFA的关键酶。在建鲤生长相关的功能基因上研究单核苷酸多态性（SNP）与生长的相关性可为建鲤的分子辅助育种提供依据。本实验筛选到建鲤（Cyprinuscarpiovar Jian）A6-Fad 和 Elovl5 基因上的 SNPs 位点。使用PCR-RFLP检测了其中3个位点（△6-Fad-a内含子10C73T、△6-Fad-b内含子10A56G和Elovl5-a内含子5C64A）在615尾（雌:雄=335:280）建鲤中的基因型分布。基因型与增重的相关性分析结果显示,△6-Fad-a内含子10C73T基因型与建鲤的增重差异显著相关（P<0.05）,在鱼种阶段,雌鱼的TT型个体增重极显著高于CC型（P<0.01）,而雄鱼的TT型个体增重也高于CC型,但差异不显著（P>0.05）;而在成鱼阶段,其雌雄鱼的TT型个体增重均显著高于CC型个体（P<0.05）。△6-Fad-b内含子10A56G基因型与建鲤的增重差异极显著相关（P<0.01）,在鱼种阶段,雌鱼的GG型个体增重极显著高于AA型（P<0.01）,而雄鱼的GG型个体增重也高于AA型,但差异不显著（P>0.05）;而在成鱼阶段,其雌雄鱼的GG型个体增重均极显著高于AA型个体（P<0.01）。对于Elovl5-a内含子5C64A基因型,在鱼种阶段,雄鱼的CC型个体增重显著高于AA型（P<0.05）,而雌鱼的CC型个体增重也高于AA型,但差异不显著（P>0.05）;在成鱼阶段,雌鱼的CC型个体增重显著高于AA型（P<0.05）,而雄鱼的CC型个体增重高于AA型,但差异不显著（P>0.05）。分析结果表明随着富集标记个数的增多,其增重也随着增大,这与数量性状特征相符。本研究结果显示,可以考虑将建鲤△6-Fad和Elovl5基因作为候选基因,用于建鲤的分子辅助育种。