论文摘要
碳青霉烯类抗生素是治疗临床感染性疾病的强有效药物,但是近年来对碳青霉烯类抗生素耐药的菌株越来越多。碳青霉烯酶尤其是可转移性碳青霉烯酶的出现和蔓延给临床治疗感染性疾病带来了巨大的挑战。本论文研究碳青霉烯类抗生素对临床分离菌株的体外抗菌活性及耐药性。对2007-2009年从北京地区医院收集的8种352株临床分离菌及标准菌株采用平皿二倍稀释法进行药敏实验,测定其对美罗培南、亚胺培南/西司他丁、帕尼培南、法罗培南的MIC值。根据MIC结果分析各种临床分离菌对碳青霉烯类抗生素的敏感性和耐药率。结果发现4种碳青霉烯/青霉烯类抗生素（美罗培南、亚胺培南/西司他丁、帕尼培南和法罗培南）总体上对北京地区临床分离的革兰阳、阴性菌都具有较强的抗菌活性,细菌的敏感率分别为82.1%,85.5%,82.1%和83.2%,耐药率分别为12.8%,12.8%,12.8%和12.5%。在革兰阴性菌中,大肠埃希菌、肺炎克雷伯杆菌和阴沟杆菌对碳青霉烯/青霉烯类抗生素耐药水平很低,仅有8.7%阴沟杆菌对法罗培南耐药,而鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌的耐药率很高,耐药率达27%-54%；在革兰阳性菌中,金黄色葡萄球菌的耐药性最强,表皮葡萄球菌和粪肠球菌次之。选择耐药率较高的鲍曼不动杆菌及铜绿假单胞菌进行碳青霉烯酶基因PCR筛选,分析耐药机制。从14株耐药铜绿假单胞菌中检测出一株携带VIM-2基因,从17株耐药鲍曼不动杆菌中均检出OXA-23基因。将VIM-2和OXA-23基因克隆至表达载体pET-30,并转化大肠埃希菌BL21细胞,成功构建了VIM-2和OXA-23蛋白表达体系,并使用酶标仪测定了纯化蛋白酶对美罗培南和亚胺培南的水解活性。以肺炎克雷伯杆菌ATCC（BAA2146）基因组为模板,构建了NDM-1基因克隆菌株。外排泵是引起大肠埃希菌多重耐药的重要机制之一。在大肠埃希菌的诸多外排泵中,AcrAB-TolC是底物谱最广,外排作用最强的的外排泵,其底物谱包括四环素、氯霉素、喹诺酮类、大环内酯类、β-内酰胺类、利福平等。本研究通过分子生物学方法,以大肠埃希菌K12标准菌株基因组DNA为模板,克隆得到了acrA-acrB基因,构建了表达质粒pET30a-acrAB。并将表达质粒pET30a-acrAB成功转化至敲除了acrAB和acrEF基因的大肠埃希菌BL21（DE3）表达宿主中,获得了基因工程菌YH216。测定了YH216对各种代表性抗生素的最小抑菌浓度（MIC）,结果表明：YH216对多种类型的抗生素的MIC值,明显高于其宿主菌和阴性对照菌。在IPTG诱导后,MIC值进一步升高。说明AcrAB外排泵得到了正确组装,具有表达活性,并且可以被诱导表达。加入质子泵抑制剂CCCP后,其MIC值与阴性对照相当,进一步验证了AcrAB外排泵的表达活性。