维生素E对牛成纤维细胞及核移植胚胎凋亡的影响

论文摘要

要提高哺乳动物核移植的效率,不仅要提高卵母细胞体外成熟（IVM）的质量,阐明成熟卵母细胞内重编程因子的产生及作用机制;也要研究能使供体细胞及早期胚胎经过处理后更易存活的方法。本文以牛胎儿成纤维细胞为核移植供体细胞,通过修饰供体细胞、受体卵母细胞及克隆胚胎的培养等核移植过程,研究了VE 对牛成纤维细胞和核移植胚胎早期发育及凋亡的影响。分别以DMEM 或M199 为基础培养液,对供体组织块进行培养,又以0.2 %胶原酶Ⅳ与0.25 %胰蛋白酶及二者按2:3 混合消化组织块,结果均得到体外培养的牛胎儿成纤维细胞。细胞可在10% DMSO 的冷冻液中-70 ℃条件下短期保存,也可在-196 ℃条件下长期保存。用血清饥饿方法对供体细胞作了G0/G1 期诱导。流式细胞仪检测显示,与对照组（61.2 %）相比,血清饥饿能使82.5 %的牛胎儿成纤维细胞进入G0/G1 期,诱导效率明显高于对照组。同时通过Hoechst33342 荧光染色、DNA凝胶电泳及流式细胞仪对饥饿后添加VE 前后牛胎儿成纤维细胞凋亡率进行了测定,结果表明:血清饥饿过程提高了牛成纤维细胞的凋亡率,100 μmol/L VE能显著降低牛胎儿成纤维细胞的凋亡率（p<0.01）,为最佳抑制浓度。研究了离子霉素（Ionomycine）与6-二甲基氨基嘌啉（6-DMAP）联用激活牛体外成熟卵母细胞的效果及抗氧化物质VE与VC 对孤雌胚体外发育率的影响。结果表明:5 μmol/L 的离子霉素能有效地起到激活作用,且激活的孤雌胚的早期囊胚发育率达39.3%,扩张囊胚发育率达24.6 %,孵化囊胚发育率达10.7 %。单独添加VE 组显著提高了体外发育率,早期囊胚发育率达43.5%,扩张囊胚发育率达30.4 %,孵化囊胚发育率达17.4 %;VE 与VC 联用组与对照组相比显著提高了体外发育率但与单独添加VE组差异不显著（p>0.05）。通过Hoechst33342 荧光染色及形态学观察,研究了VE 处理的供体细胞及其传代次数对牛核移植胚胎早期发育及凋亡的影响。结果表明:卵母细胞在发育及成熟过程中有凋亡现象的发生;重构胚胚泡在发育过程中卵裂球会发生凋亡。100 μmol/L VE 处理的供体细胞构建的重构胚胚泡卵裂球凋亡率显著降低（p<0.05）,从而提高早期胚胎的体外发育率;用长期培养（>25 代）的供体细胞进行核移植时,造成高的卵裂球凋亡率,但并不影响附植前胚胎的发育和胚泡细胞总数。研究了抗氧化物质VE 处理的5-7 代成纤维细胞作供体细胞,经凋亡形态学筛选后

论文目录

• 文献综述
• 第一章 细胞凋亡研究进展
• 1.1 细胞凋亡的形态学和生化特征
• 1.1.1 细胞凋亡与细胞坏死的区别
• 1.1.2 细胞凋亡的形态学变化
• 1.1.3 细胞凋亡的生化特征
• 1.2.2 ICE 基因家族
• 1.2.3 p53 基因
• 1.2.4 与细胞凋亡相关的其它基因
• 1.3 细胞凋亡的通路研究进展
• 1.3.1 死亡受体通路
• 1.3.2 线粒体通路
• 1.3.3 内质网通路
• 1.4 细胞凋亡检测方法
• 1.4.1 形态学观察
• 1.4.2 线粒体膜势能的检测
• 1.4.3 生化特征的检测
• 1.4.4 流式细胞仪（flow cytometry,FCM）检测技术
• 1.4.5 Caspase-3 活性的检测
• 第二章 卵母细胞和早期胚胎凋亡研究进展
• 2.1 卵母细胞凋亡
• 2.1.1 被忽视死亡（death by neglect）
• 2.1.2 因缺陷死亡（death by defect）
• 2.1.3 自我牺牲死亡（death by self sacrifice）
• 2.2 胚胎凋亡
• 2.2.1 哺乳动物核移植胚胎的构建
• 2.2.2 胚胎细胞凋亡
• 2.3 维生素E 抑制生殖细胞凋亡作用研究进展
• 实验研究
• 第一章 维生素E 对新生牛成纤维细胞凋亡的影响
• 1.1 材料和方法
• 1.1.1 材料
• 1.1.2 实验方法
• 1.2 结果
• 1.2.1 成纤维细胞的形态学观察
• 1.2.2 DNA 凝胶电泳结果
• 1.2.3 流式细胞仪检测结果
• 1.3 讨论
• 1.3.1 成纤维细胞凋亡的形态学变化
• 1.3.2 成纤维细胞凋亡的生化特征改变
• 1.3.3 维生素E 对成纤维细胞凋亡的影响
• 第二章 维生素E 对牛孤雌胚胎体外发育的影响
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 主要试剂
• 2.1.2 方法
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 维生素E, 维生素C 对牛孤雌胚胎发育的影响
• 2.2.2 荧光染色结果
• 2.3 讨论
• 第三章 维生素E 对牛核移植胚胎早期发育及凋亡的影响
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 实验方法
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 牛耳缘成纤维细胞的培养
• 3.2.2 卵母细胞体外成熟
• 3.2.3 核移植胚胎的体外培养
• 3.2.4 细胞代数与维生素E 处理对克隆胚胎体外发育的影响
• 3.2.5 克隆胚凋亡的荧光染色
• 3.2.6 维生素E 对牛核移植胚胎体外发育及凋亡的影响
• 3.3 讨论
• 结论
• 致谢
• 参考文献
• 作者简介