骨髓基质干细胞表达小鼠白介素-18治疗大鼠脑胶质瘤的实验研究

论文摘要

脑胶质瘤是颅内最常见的恶性肿瘤,尽管外科手术水平、放疗、化疗技术不断提高,但是都没有显著改善脑胶质瘤患者的预后。胶质瘤由于具有高度增殖、浸润生长及“微随体”播散的特征,手术只能切除大部分肿瘤,并不能彻底根除残存的肿瘤细胞,所以容易复发。因此,必须寻找新的治疗策略杀伤浸润到正常脑组织中残留的肿瘤细胞。随着生物技术的发展及应用,转基因技术治疗逐渐成为新的发展方向。目前,基因治疗主要包括:自杀基因、免疫基因和破坏肿瘤血管及联合基因等几个方面。以上基因治疗策略,虽然各有优缺点,但实现胶质瘤的基因治疗的关键是:（1）目的基因向靶细胞迁移,到达肿瘤浸润的大脑实质;（2）持续、高效表达目的基因并消灭残存的肿瘤细胞。而目前这些治疗策略效果不满意的主要原因之一是使用病毒载体,病毒载体普遍携带基因量不足且向靶细胞迁移的能力差,于是人们在探索新的治疗方法—基因修饰的干细胞治疗脑胶质瘤。近年研究发现,肿瘤微环境中的各种因子可以趋化并促进骨髓基质干细胞（Bone marrow stroma stem cells,BMSCs）增殖,转染外源基因的骨髓基质干细胞主要集中于肿瘤的边缘,并稳定表达目的基因。肿瘤恶性程度越高则骨髓基质干细胞的迁移能力就越强,而且还可以追踪“微随体”;移植入大脑半球的骨髓基质干细胞更容易向肿瘤组织迁移。BMSCs还通过其自身的合成与分泌各种促生长因子,与受损脑组织相互作用诱导分化出功能神经细胞,完成胶质瘤及手术造成脑损伤的自我修复与重建。其中,分泌的神经生长因子（Nerve growth factor,NGF）不仅能够抑制神经元的凋亡,而且能够诱导胶质瘤细胞的分化和直接抑制胶质瘤的生长。BMSCs还分泌大量的血管源性因子,包括血管生成素-1（Angiopoietin-1,Ang-1）,而Ang-1可以抑制肿瘤的生长,和防止肿瘤血管渗漏,能够减轻脑胶质瘤造成的水肿。除此之外,BMSCs还具有易于与宿主细胞整和、稳定持续表达外源性基因、无免疫排斥反应等特点。总之,使用骨髓基质干细胞作为胶质瘤基因治疗的载体,成为胶质瘤基因治疗的热点和新的发展方向。白介素-18（Interleukin-18,IL-18）是新近发现的一种具有多种生物学活性的多功能细胞因子,它可以诱导干扰素-γ（Interferon-γ,IFN-γ）产生,在肿瘤的原发性、继发性免疫中起重要作用。与其他细胞因子相比,IL-18的抗肿瘤效应更强大,时间更持久,且毒副作用较低。IL-18可刺激辅助性T淋巴细胞-1（T helpercell-1,TH1）细胞分泌白介素-2（Interleukin-12,IL-2）、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（Granμlocyte-macropHage colony stimutaing factor,GM-SCF）;INF-γ促进TH1细胞增殖,能使新生CD4+T极化为Th1细胞和增加Th1细胞Fas配体媒介的细胞毒性作用。IL-18还可促进Fas-Fas-1配体媒介自然杀伤（Natural killer,NK）细胞的细胞毒活性;又可促进穿孔素介导NK细胞对靶细胞的传统杀伤活性;而且还具有抑制肿瘤血管形成等作用。系统应用IL-18可以有效地促进原发性肿瘤及转移灶的消退,这在许多肿瘤动物模型中已得到证实。本课题研究主要内容是:利用BMSCs的肿瘤趋向性特点和IL-18的抑制肿瘤生长的功能,构建携带IL-18的复制缺陷型腺病毒载体,转染BMSCs,然后移植入9L胶质瘤细胞建立的Fisher 344大鼠胶质瘤模型中,观察携带IL-18的BMSCs对脑胶质瘤的治疗作用,为脑胶质瘤的基因治疗探寻新的思路和策略。本研究主要包括三部分。第一部分、重组腺病毒载体Ad-mIL-18的构建及包装目的:构建表达mIL-18的复制缺陷型腺病毒载体,并进行包装、鉴定、纯化及滴度测定为后续研究奠定基础。方法:限制性内切酶HindⅢ、EcoRⅤ分别消化真核表达质粒Pcr3.1uni-mIL-18和穿梭质粒pAdTrack-CMV,琼脂糖凝胶电泳回收、纯化目的片段,T4连接酶连接,构建出穿梭质粒pAdTrack-mIL-18。氯化钙法制备含有骨架质粒pAdEasy-1的大肠杆菌BJ5183感受态细胞;重组穿梭质粒pAdTrack-mIL-18经限制性内切酶HindⅢ、EcoRⅤ和基因测序鉴定正确后;用限制性内切酶PmeⅠ线性化处理后与上述感受态细胞在细菌中进行同源性重组,构建复制缺陷型腺病毒载pAd-mIL-18。PacⅠ线性化处理后在人胚肾（Human embryonic kidney 293,HEK293）细胞中进行包装,PCR法对重组子进行鉴定、氯化铯法纯化、倍比稀释法检测病毒滴度。结果:成功构建了复制缺陷型腺病毒载体pAd-mIL-18;并在KEK 293细胞中完成包装;经鉴定病毒液中包含mIL-18的完整序列,倍比稀释法检测病毒滴度为2.45×1010PFU/ml。结论:（1）“两步法”细菌内同源性重组构建复制缺陷型腺病毒载体具有成功率高、方法简便、快捷、实验周期短等优点。（2）HEK293细胞包装重组腺病毒技术成熟、结果稳定、可靠。（3）倍比稀释法检测病毒滴度,简单、可靠;氯化铯法纯化病毒滴度高,能够满足体内外实验的需求。第二部分、Fisher 344大鼠骨髓基质干细胞的体外扩增及鉴定目的:建立一种简便可行的Fisher 344大鼠骨髓基质干细胞（Bone marrow stromastem cells,BMSCs）体外培养、扩增方法,并对其免疫表型、细胞周期、生长曲线、超微结构、等方面进行初步分析。方法:应用密度梯度离心法分离Fisher 344大鼠BMSCs,条件培养基培养。倒置相差显微镜下观察BMSCs形态学变化;流式细胞仪检测BMSCs的表面标记以及细胞周期;MTT法检测BMSCs的增殖;扫描电镜和透射电镜观察BMSCs的超微结构。结果:密度梯度离心法分离出的BMSCs纯度较高。典型的BMSCs贴壁生长,以长梭形为主,体积小,核浆比大,呈明显的同向性改变,漩涡状盘旋排列。细胞存活率均大于95%。流式细胞仪检测BMSCs CD29阳性表达细胞比率为95.3%,CD34阳性细胞比率为1.8%,CD44阳性细胞比率为94.7%,CD45阳性细胞比率为0.8%,CD71阳性细胞比率为96.2%。BMSCs的生长曲线呈S形,S+G2+M期的细胞为17.1%,大部分细胞仍是处于静止状态。BMSCs的超微结构显示BMSCs表面较多突起,孔隙较多,胞质丰富,粗面内质网发达,囊腔扩张,可见大量蛋白分泌物,说明BMSCs具有较强的增殖能力。结论:（1）应用密度梯度离心法可得到纯度较高的BMSCs。（2）BMSCs表达基质干细胞而非造血干细胞的表型特征。（3）大部分细胞处于静止状态,但BMSCs具有较强的增殖能力,能够在体外大量扩增培养。第三部分、表达Ad-mIL-18骨髓基质干细胞对大鼠脑胶质瘤的抑制作用目的:观察复制缺陷型腺病毒Ad-mIL-18感染BMSCs的效率、对BMSCs细胞生物学特性的影响和目的基因的表达,及研究脑内移植对大鼠脑胶质瘤的抑制作用,并对其作用机制做初步探讨。方法:以不同感染复数（multiplicity of infection,MOI）空白对照（a）、50（b）、100（c）、200（d）、的Ad-mIL-18感染BMSCs,荧光显微镜观察转染效率、MTT法检测BMSCs增殖、β-巯基乙醇（β-mercaptoethanol,β-ME）诱导转染Ad-mIL-18的BMSCs向神经样细胞分化、RT-PCR法及ELISA法分别检测感染Ad-mIL-18的BMSCs 3天后的mIL-18mRNA的表达和细胞因子的分泌。立体定向法建立9L/Fisher 344大鼠脑胶质瘤模型,3天后随机将荷瘤大鼠分为:生理盐水组（n=9）、BMSCs移植组（n=10）、BMSCs-GFP移植组（n=10）和BMSCs-mIL-18移植组（n=10）,并进行细胞移植;生理盐水组:原位注射10μl生理盐水、BMSCs移植组:1×106BMSCs（10μl）、BMSCs-GFP移植组:移植感染Ad-GFP的1×106BMSCs（10μl）、BMSCs-mIL-18移植组:移植感染Ad-mIL-18的1×106BMSCs（10μl）。观察大鼠的神经行为学变化、生存时间、MRI动态检测肿瘤大小、治疗2周后分别采用RT-PCR法及ELISA法检测肿瘤组织中mIL-18mRNA的表达和细胞因子的分泌、免疫组织化学法检测大鼠大脑中CD4+、CD8+细胞表达。BMSCs-mIL-18移植组大鼠存活超过2月的再次原位接种同样数量的9L细胞,观察是否有免疫记忆效应形成。结果:Ad-mIL-18感染BMSCs后24h,即可见绿色荧光表达;一周时,不同感染复数（MOI）的感染率分别为:a（0）、b（55%）,c（85%）、d（88%）,但d组出现细胞病理现象;7d荧光表达最强;28 d仍有表达。当MOI达到200时,对细胞增殖产生抑制。经β-ME诱导可以分化为神经元样细胞。BMSCs感染Ad-mIL-18,3天后表达mIL-18mRNA,分泌mIL-18的量分别为:MOI=50（a）组:45.6±5.3（ng/106 cells/72 h）;MOI=100（b）组:89.2±4.9;（ng/106 cells/72 h）;MOI=200（C）组:90.8±4.1（ng/106 cells/72 h）。统计学分析发现:a组与b、c组之间有显著性差异（P＜0.05）;而b、c组之间无显著性差异（P=0.488）。2周时,各组大鼠肿瘤组织分泌mIL-18的量分别为:盐水组1.6±0.3 pg/mg;BMSCs移植组:1.8±0.1 pg/mg;BMSCs-GFP组为1.8±0.1 pg/mg;BMSCs-mIL-18移植治疗组53.8±3.3 pg/mg。BMSCs-mIL-18移植治疗组与其余各组之间比较有显著性差异（P＜0.01）生理盐水组与BMSCs组（P=0.755）、BMSCs-GFP组（P=0.740）无显著性差异。BMSCs-mIL-18移植组荷瘤大鼠的生存时间最长,40%大鼠存活时间超过60天,与其余各组比较有显著性差异（P＜0.01）;BMSCs及BMSCs-GFP移植组大鼠生存时间较生理盐水组明显延长（P＜0.01）;BMSCs与BMSCs-GFP移植组之间无显著性差异（P=0.919）。MRI检测各组大鼠肿瘤大小发现:7天、14天时BMSCs组、BMSCs-GFP组、BMSCs-mIL-18组与生理盐水组比较有显著性差异（P＜0.01）,BMSCs-mIL-18组与BMSCs组、BMSCs-GFP组比较有显著性差异（P＜0.01）;而BMSCs组与BMSCs-GFP组之间无显著性差异（7天时P=0.725;14天时P=0.620）;21天时生理盐水组大鼠全部死亡,BMSCs-mIL-18组与BMSCs、BMSCs-GFP组比较均有显著性差异（P＜0.01）;而BMSCs组与BMSCs-GFP组之间无显著性差异（P=0.839）;28天时仅剩BMSCs-mIL-18组大鼠存活,28天、56天时它们的肿瘤体积仍相对较小,分别为51.30±2.56 mm3和59.57±2.50 mm3。免疫组化染色发现:BMSCs-mIL-18移植组大鼠肿瘤组织内部及与正常脑组织边界有大量CD4+、CD8+淋巴细胞浸润,而BMSCs-GFP组未见CD4+、CD8+淋巴细胞浸润。BMSCs-mIL-18组长期存活的再次接种肿瘤细胞后存活时间超过90天。结论:（1）复制缺陷型腺病毒pAd-mIL18可以有效感染Fisher344大鼠BMSCs,对BMSCs的细胞生物学特性无明显影响。（2）感染pAd-mIL18的BMSCs,不仅能够在mRNA水平表达,而且能够分泌一定量的细胞因子。（3）立体定向技术建立9L/Fisher344脑胶质瘤模型可靠、稳定,适宜于进行基因和免疫治疗。（4）BMSCs-mIL-18能够有效抑制Fisher344大鼠脑胶质瘤。（5）CD8+T、CD4+T细胞浸润可能是BMSCs-mIL-18抑制Fisher344大鼠脑胶质瘤的机制之一。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 研究背景
• 参考文献
• 第一章 重组腺病毒Ad-mIL-18的构建及包装
• 1、引言
• 2、材料
• 3、方法
• 4、结果
• 5、讨论
• 6、结论
• 参考文献
• 第二章 大鼠骨髓基质千细胞的扩增及鉴定
• 1、引言
• 2、材料
• 3、方法
• 4、结果
• 5、讨论
• 6、结论
• 参考文献
• 第三章 表达Ad-mIL-18骨髓基质干细胞对大鼠脑胶质瘤的抑制作用
• 1、引言
• 2、材料
• 3、方法
• 4、结果
• 5、讨论
• 6、结论
• 参考文献
• 全文小结
• 综述一
• 综述二
• 附录（缩略词中英文对照表）
• 成果
• 致谢
• 研究生毕业论文统计学审稿证明