水牛体细胞核移植与甲基化检测的研究

论文摘要

探讨了DNA甲基化转移酶抑制剂5-氮-2-脱氧胞苷对水牛成纤维细胞DNA甲基化的影响。第六代水牛成纤维细胞经不同浓度的5-氮-2-脱氧胞苷（0μM，0.005μM，0.01μM，0.03μM，0.09μM）处理72h后，用抗5-甲基胞嘧啶一抗及FITC二抗结合后流式细胞仪进行荧光定量。结果表明，5-氮-2-脱氧胞苷能改变水牛成纤维细胞的DNA甲基化水平，使其DNA甲基化水平呈下降趋势。探讨了5-氮-2-脱氧胞苷对水牛体细胞核移植效果的影响。用不同浓度的5-氮-2-脱氧胞苷（0μM，0.005μM，0.01μM，0.03μM，0.09μM）处理水牛成纤维细胞72h作供核时，其融合率以0.09μM组最低，显著低于其它四组（55.3％比72.1％，68.2％，75.3％，73.4％，P＜0.05），核移植后的重组胚的分裂率各组间无显著差异（P＞0.05），重组胚囊胚发育率以0.03μM最高，显著高于其它四组（26.5％比15.6％，14.4％，17.5％，6.02％，P＜0.05）；浓度为0.03μM的5-氮-2-脱氧胞苷处理水牛成纤维细胞不同时间（0h，24h，48h，72h，96h）作供核时，其融合率各组间无显著差异（P＞0.05），重组胚的分裂率以96h组最低，显著低于72h组（74.3％比85.1％，P＜0.05）。而72h组囊胚发育率显著高于对照组（25.6％比14.6％，P＜0.05）。结果表明，0.03μM的5-氮-2-脱氧胞苷处理水牛供体成纤维细胞72h时，能提高水牛体细胞核移植效果。探讨水牛体细胞核移植（SCNT）和体外受精（IVF）早期胚胎发育过程中的单细胞核全基因组DNA甲基化模式。对各发育阶段的胚胎进行间接免疫荧光结合后激光共聚焦显微镜下荧光半定量。发育相同阶段的水牛SCNT胚胎的单核全基因组DNA的甲基化平均水平高于水牛IVF胚胎，且4细胞、8细胞及桑葚胚阶段，SCNT胚胎的单核全基因组DNA的甲基化水平显著高于IVF胚胎（P＜0.05）；从2细胞至8细胞阶段，水牛SCNT和IVF胚胎单核全基因组DNA甲基化的相对水平都呈下降趋势，而从桑葚胚至囊胚阶段上升，到囊胚阶段二者胚胎的单核全基因组DNA的甲基化水平达最高。然而，从2细胞阶段开始，水牛SCNT胚胎的DNA去甲基化不完全。以上结果表明，水牛体细胞核移植（SCNT）的早期胚胎出现异常的DNA甲基化模式。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一部分 文献综述
• 体细胞核移植机理研究进展
• 一、核重编程
• （一） DNA甲基化
• （二） 组蛋白乙酰化
• （三） X染色体失活
• （四） 端粒
• （五） 印迹基因表达
• 二、核质互作
• 三、胚胎细胞凋亡
• 四、染色体异常
• 五、线粒体
• 第二部分 实验研究
• 第一章 5-AZA-DC对水牛体细胞核移植效果的影响
• 1 材料和方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 结论
• 第二章 水牛体细胞核移植胚胎和体外受精胚胎甲基化检测
• 1 材料和方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士学位期间发表论文