论文摘要
猪链球菌（Streptococcus suis,SS）是一种重要的人畜共患病病原,根据菌体荚膜多糖抗原性的不同,分为35个血清型（1-34型,1/2型）。世界范围内以SS2流行最广,致病性最强。猪链球菌2、7、9型是国内外猪链球菌感染的常见血清型,为了快速准确地分析大量样本中上述3个血清型的流行情况,根据GenBank发表的三个型的荚膜多糖合成相关基因设计合成三对引物,建立三重PCR检测方法。利用此方法对广东省2个屠宰场的160份样本进行检测,并验证三重PCR的特异性及敏感性。结果表明,160份扁桃体样本中检出3株SS9,12株SS2;对未检出的样本再次用单个PCR进行检测,并未发现有漏检的样本。该三重PCR只对2、7、9三个血清型具有特异性,该三重PCR检测猪链球菌其它血清型及其它链球菌结果均为阴性。敏感极限为500CFU/每个反应。所建立的三重PCR特异性强,敏感性好,可用于对大量样本的流行病学调查。国外对猪链球菌毒力因子的研究发现SS2菌株有多种基因型,致病性最强的基因型为cps2+/epf+/mrp+/sly+。而SS9分离株的毒力基因分布情况尚未见报道,本实验检测国内7株SS9分离株7种主要毒力基因—谷氨酸脱氢酶（gdh）、荚膜多糖合成相关基因（cps）、溶菌酶释放蛋白（mrp）、胞外因子（cpf）、溶血素（sly）、纤连蛋白/血纤蛋白原结合蛋白（fpbs）和毒力相关基因orf2,设计与合成7对引物,进行PCR检测。结果显示:1株脑膜炎分离株GZ0565表现为cps9H+/gdh+/epf-/mrp+/sly-/fbps+/orf2+,扁桃体分离株中仅1株表现为cps9H+/gdh+/epf-/mrp+/sly-/fbps+/orf2-,其它表现为cps9H+/gdh+/cpf-/mrp-/sly-/fbps+/orf2-。通过对7株SS9的cps9H的300bp碱基测序,并将所测序列用laser软件进行同源性分析和进化树绘制,比对结果说明,病猪脑脊液分离株与扁桃体分离株荚膜基因存在明显差异。为比较SS9不同来源菌株间的毒力差异,用7株SS9国内分离株和1株SS9参考株22083以及SS2分离株HA9801对ICR小鼠进行毒力预试验,选择对小鼠有毒力的GZ0565和GD0606测定半数致死量,并比较GZ0565和GD0606以及GD0627之间的交叉保护性。结果显示:GZ0565和GD0606能够致死小鼠,两株细菌均能引起典型的脑膜炎临床症状,并能够从脑脊液中分离到这2株细菌;而其它扁桃体分离株以及SS9参考株22083,SS2强毒株HA9801对小鼠均不致死,也无可见临床症状;可见小鼠可区分SS9菌株间的毒力差异,不适于SS2感染的动物模型。对小鼠有毒力的GZ0565和GD0606具有mrp+ epf-基因表型,而对小鼠无毒力扁桃体分离株均未检测到mrp基因,表明mrp基因差异与SS9毒力差异有相关性。灭活的GZ0565菌株免疫小鼠对同源菌株GZ0565及GD0606的攻击免疫保护率均为100%（10/10）,而灭活的GD0606和未灭活的GD0627对GD0606攻击免疫保护率分别为80%（8/10）和50%（5/10）,对GZ0565攻击的免疫保护率分别为60%（6/10）和30%（3/10）。用SS9脑膜炎分离株GZ0565扁桃体分离株SH040917和SS2分离株HA9801静脉攻击广东某地土种猪,每株细菌各攻击3头猪。将以上菌株灭活后免疫广东某地土种猪,每株细菌免疫3头猪,GZ0565免疫组用HA9801攻击,HA9801免疫组用GZ0565攻击,SH040917免疫组用GZ0565攻击。结果显示:5×106CFU的HA9801攻击的3头猪均在16h内死亡;GZ0565攻击的猪发生关节炎,但未有猪死亡;SH040917未引起猪死亡,也未见典型临床症状。GZ0565免疫组对HA9801产生一定保护力,但不完全,2/3保护,SH040917免疫组对GZ0565保护率1/3,2/3猪有关节炎。灭活的HA9801免疫组在GZ0565攻击后,未有关节炎,仅部分试验猪剖解后有器官病变。可见:SS9脑膜炎分离株GZ0565对猪的毒力高于扁桃体分离株SH040917,而低于SS2强毒株HA9801。GZ0565和HA9801具有共同免疫保护性抗原,此种抗原能够对GZ0565和HA9801产生一定免疫保护力,为研究针对多个血清型疫苗提供依据。SS9分离株GZ0565和SH040917存在致病力和免疫力差异。
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