L-乳酸生产菌凝结芽孢杆菌的定向育种与发酵条件优化

论文摘要

凝结芽孢杆菌发酵L-乳酸有较高的光学纯度、发酵转化率高、能源消耗少,可以实现利用玉米粉糖化液直接进行L-乳酸发酵。然而在发酵生产过程中,由于直接糖化液有部分二糖、三糖和四糖等寡糖存在,凝结芽孢杆菌对这些糖类分解速率较低,对乳酸提取精制影响很大,影响了乳酸的市场应用。本研究将围绕残糖快速消耗问题,通过选择性的诱变育种方案和发酵条件优化实验,提升凝结芽孢杆菌残留总糖消耗的能力,缩短发酵周期,降低生产成本。利用紫外和氯化锂、与光敏试剂8-MOP分别处理生产菌株,以麦芽酮糖为碳源,利用选择性的碳酸钙溴甲酚紫平板培养基进行筛选,得到一株麦芽酮糖消耗较快的变异株UM-27,进而利用连续培养的方法,通过控制稀释速率和不断增加的麦芽酮糖浓度,对该突变株UM-27进行驯化,该筛选到的菌株具有较高的残留总糖消耗能力。接着,在摇瓶中进行了影响L-乳酸合成的培养基条件的优化。先在摇瓶中采用Plackett-Burman因素考察试验,分析了培养基中主要底物玉米浆、磷酸二氢钾、蛋白胨、硫酸铵、硫酸镁、硫酸锰、硝酸钠和碳酸钙,对乳酸合成的影响。找出了玉米浆、碳酸钙、磷酸二氢钾为关键影响因素。再利用中心组合响应面实验设计和统计分析,得到最优化培养基浓度,在该培养基基础上做进一步的发酵过程优化实验。最后,在5 L发酵罐中利用筛选到菌株UM-27A进行发酵实验,对影响发酵的关键因素通气比、转速、过程pH和温度进行了优化研究。研究结果表明,通气比为0.03、转速为200 rpm、pH值为5.3,并采用两阶段的温度,前期45℃和后期50℃控制模式时,为最优的发酵控制工艺,葡萄糖消耗阶段的周期（26 h）与原始菌株相比（42h）缩短了19 h。同时残留总糖的浓度降到0.4%以下的时间从96 h缩短到了45-50 h,该工艺能明显提高乳酸的生产效率和产品质量。该突变菌株的获得和关键发酵条件的控制优化研究,为进一步的工业发酵工艺放大和优化奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
• 1.1 乳酸的性质及其用途
• 1.1.1 乳酸的理化性质及生产现状
• 1.1.2 乳酸及其衍生物的用途
• 1.1.3 聚乳酸研究及产业化现状
• 1.2 L-乳酸的生产
• 1.2.1 化学合成法
• 1.2.2 酶法
• 1.2.3 发酵生产乳酸
• 1.3 发酵生产乳酸现状
• 1.3.1 菌种
• 1.3.2 基质条件研究进展
• 1.3.3 发酵工艺开发
• 1.4 本课题研究的意义和主要内容
• 第2章 高效降解麦芽酮糖Bacillus coagulans的定向选育
• 2.1 引言
• 2.2 材料与分析方法
• 2.2.1 实验材料
• 2.2.2 培养方法
• 2.2.3 诱变育种方法
• 2.2.4 菌株的驯化
• 2.2.5 乳酸检测
• 2.3 结果和分析
• 2.3.1 凝结芽孢杆菌Bacillus coagulans发酵过程曲线变化分析
• 2.3.2 高产乳酸菌株的筛选
• 2.3.3 紫外氯化锂诱变
• 2.3.4 光敏试剂诱变选育
• 2.3.5 菌株的驯化
• 2.3.6 突变菌株与原始菌株的发酵情况对比
• 2.4 小结
• 第3章 发酵培养基的优化
• 3.1 引言
• 3.2 材料与分析方法
• 3.2.1 实验材料
• 3.2.2 培养方法
• 3.2.3 实验设计
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 Plackett-Burman试验因素考察
• 3.3.2 中心组合实验优化结果分析
• 3.4 小结
• 第4章 凝结芽孢杆菌乳酸发酵工艺条件优化
• 4.1 引言
• 4.2 分析和测定方法
• 4.2.1 pH测定
• 4.2.2 菌体浓度测定
• 4.2.3 乳酸发酵液中糖含量的测定
• 4.2.4 胞外有机酸浓度测定
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 通气量对凝结芽孢杆菌发酵过程的影响
• 4.3.2 不同转速对发酵过程的影响
• 4.3.3 不同pH对发酵过程的影响
• 4.3.4 温度对凝结芽孢杆菌合成乳酸的影响
• 4.3.5 优化的L-乳酸发酵过程控制工艺
• 4.4 小结
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历