绵羊种布鲁氏菌致病的分子机制研究

论文摘要

目的:布鲁氏菌病是由布鲁氏菌引起的一种人、畜共患传染病。人感染后表现为“波浪热”,家畜感染后易造成流产。病原学研究发现,布鲁氏菌外膜蛋白和Ⅳ型分泌系统家族蛋白与布鲁氏菌的侵染、胞内生存、繁殖有直接关系,是公认的毒力因子。探讨布鲁氏菌的胞内寄生机制的分子基础与布鲁氏菌毒力因子和巨噬细胞靶蛋白结合密不可分,进而为绘制布鲁氏菌表面蛋白与巨噬细胞相互作用的蛋白质网络提供技术方案,为选择布鲁氏菌病药物作用的侯选靶点奠定理论依据,为抗布鲁氏菌病的绵羊抗病育种工作提供可供筛选、比较的侯选基因。方法:（1）利用高变8聚核苷酸DNA指纹技术（HOOF-Prints）对绵羊种布鲁氏菌019株可变数目重复片段（VNTR）的8个位点进行PCR扩增和序列测定,将测定结果与GenBank数据库比较分析,构建系统进化树,确立绵羊种布鲁氏菌019株在布鲁氏菌分类学中的地位;（2）用分子克隆技术对绵羊种布鲁氏菌019株的目标基因（外膜蛋白基因omp31和Ⅳ型分泌系统蛋白基因virB2、virB3、virB5、virB8基因）进行克隆、测序,并将目标基因构建到酵母双杂交诱饵载体pGBKT7中;（3）建立绵羊种布鲁氏菌019株侵染绵羊肺泡巨噬细胞的感染模型,利用酵母双杂交捕获载体系统构建绵羊巨噬细胞cDNA文库;（4）利用构建的酵母双杂交诱饵系统和捕获系统进行巨噬细胞捕获蛋白的筛选,并对部分捕获蛋白应用免疫共沉淀验证,确立互作的靶蛋白。结果:（1）绵羊种布鲁氏菌019株八个位点的重复序列与参考株对应序列相比,一致性较差,只有Locus1,Locus6和Locus8与绵羊种布鲁氏菌标准株63/290的对应位点重复序列一致,而019株的8个位点重复序列与B. abortus 2308、B. suis 1330的对应位点没有共同的重复序列次数,遗传进化树分析,绵羊种布鲁氏菌019株与标准株63/290的亲缘关系最高;（2）测序表明绵羊种布鲁氏菌019株omp31、virB2、virB3、virB5和virB8基因与参考株对应基因相比,两者omp31基因的同源性为98%,两者virB5、virB8基因的同源性为99%,两者virB2、virB3基因的同源性为100%,携带有目标基因的诱饵系统无自激活活性;（3）构建的绵羊种布鲁氏菌019株侵染绵羊巨噬细胞cDNA文库的库容量为1.364×105,重组率为95.65%;（4）酵母双杂交结果显示:pGBKT7-omp31诱饵质粒最终获得2个阳性AD质粒,这些质粒的插入片段与牛的特异性半乳糖苷凝集素、趋化因子配体16高度同源;pGBKT7-virB2诱饵质粒最终获得3个阳性AD质粒,这些质粒的插入片段与牛的CD48分子、趋化因子配体、溶酶体辅助蛋白2高度同源;pGBKT7-virB3诱饵质粒最终获得2个阳性AD质粒,这些质粒的插入片段与牛的溶酶体辅助蛋白2、未知蛋白高度同源; pGBKT7-virB5诱饵质粒最终获得3个阳性AD质粒,这些质粒的插入片段与牛的嘌呤核苷酸磷酸酶、含铁素重链多肽、26S蛋白酶体非ATP酶调节亚基8高度同源;pGBKT7-virB8诱饵质粒最终获得9个不同的阳性AD质粒,这些质粒的插入片段与牛的IGS15泛素样修饰子、肿瘤坏死因子诱导蛋白、脂肪酸结合蛋白4、C19 orf10样蛋白、趋化因子配体16、N-myc作用子、类固醇样急性调节蛋白、2种未知蛋白高度同源;免疫共沉淀结果显示:外膜蛋白OMP31与绵羊巨噬细胞特异性半乳糖苷凝集素和类趋化因子（C-X-C motif）配体16发生相互作用;Ⅳ型分泌系统家族蛋白VirB5与绵羊巨噬细胞含铁素重链多肽发生相互作用。结论:（1）绵羊种布鲁氏菌019株为非典型绵羊种布鲁氏菌;（2）构建的诱饵系统无自激活活性,满足酵母双杂交诱饵系统的要求;（3）构建的绵羊种布鲁氏菌019株侵染绵羊巨噬细胞cDNA文库库容大于1.0×105,重组率大于95%,满足酵母双杂交的建库要求;（4）酵母双杂交筛选与布鲁氏菌5种表面蛋白相互作用的19种巨噬细胞捕获蛋白,免疫共沉淀实验确认3种巨噬细胞靶蛋白与布鲁氏菌的2种表面蛋白相互作用。

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中文摘要

Abstract

前言

第一章文献综述

综述一布鲁氏菌病的研究进展

1 布鲁氏菌病的流行状况

2 布鲁氏菌病的研究历史

3 布鲁氏菌的分类

4 布鲁氏菌的理化特性

5 布鲁氏菌的细胞壁结构

6 布鲁氏菌的基因组

7 布鲁氏菌的致病作用

8 布鲁氏菌的毒力因子

9 外膜蛋白（OMPs）

10 Ⅳ型分泌系统

11 布鲁氏菌VirB 区的鉴定

12 VirB 序列分析

13 细胞内VirB 诱导需要吞噬体的酸化

14 VirB 的作用

15 布鲁氏菌病的防治措施

16 绵羊种布鲁氏菌019 株的研究

综述二蛋白质相互作用研究基因功能的主要方法

1 酵母双杂交系统

2 噬菌体展示技术

3 亲和层析技术

4 免疫共沉淀技术

参考文献

第二章实验部分

实验一绵羊种布鲁氏菌019 株的鉴定

2.1.1 材料与方法

2.1.2 结果

2.1.3 讨论

参考文献

实验二 B.ovis 019 株目标基因的克隆和诱饵蛋白载体的构建

2.2.1 材料与方法

2.2.2 结果

2.2.3 讨论

参考文献

实验三绵羊种布鲁氏菌 019 株侵染绵羊巨噬细胞 cDNA 文库的构建

2.3.1 材料与方法

2.3.2 结果

2.3.3 讨论

参考文献

实验四与 B.ovis 019 株诱饵蛋白作用的捕获蛋白的筛选与验证

2.4.1 材料与方法

2.4.2 结果

2.4.3 讨论

参考文献

第三章结论及创新点

3.1 结论

3.2 创新点

附录：常用培养基和溶液的配制

1 常用培养基的配制

2 常用溶液的配制

3 绵羊种布鲁氏菌基因组提取试剂

4 质粒DNA 的提取试剂

致谢

个人简历

石河子大学博士研究生学位论文导师评阅表

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