论文摘要
目的癌细胞侵袭和转移是一个复杂的过程，涉及到多方面的因素作用，细胞与细胞外基质（extracelullar matrix，ECM）的黏附是恶性肿瘤侵袭的首要步骤。肿瘤细胞与ECM的黏附是通过细胞表面的特异受体介导的，其中最重要的黏附分子为整合素家族。近来研究发现，肿瘤细胞表面的整合素受体与ECM黏附所致的肿瘤细胞游离出或通过基底膜的过程，是恶性肿瘤浸润生长和远处转移的始动步骤。生腱蛋白（Tenascin-c，TN-c）是ECM中一种具有独特六臂体结构的寡聚糖蛋白，也是整合素的重要配体之一。p38MAPK是丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）家族的重要成员，最近，p38MAPK信号通路因以正性调节的方式参与肿瘤的侵袭转移过程而倍受关注。为此，本研究检测了p-p38，整合素β3及其配体在乳腺癌组织中的表达情况，并进一步在体外研究p38MAPK通路与整合素β3的关系，为乳腺癌治疗提供相应的理论依据。材料与方法1、材料80例乳腺癌组织蜡块取自中国医科大学第一临床学院病理科，为2001年～2005年手术切除标本。依据WHO2003年所推荐的乳腺癌组织学分类标准进行分类，80例均为浸润性导管癌。人乳腺癌细胞系MDA-MB-231及MCF-7购自协和医科大学细胞库。2、主要试剂鼠抗人p-p38单克隆抗体和兔抗人整合素β3多克隆抗体购自Cell signaling公司，鼠抗人TN-c单克隆抗体购自Sigma公司，链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶（S-P）超敏免疫组化试剂盒、DAB酶底物显色试剂盒均购自福州迈新公司。DMEM及RPMI 1640培养基购自Gibco公司。3、方法免疫组织化学步骤采用SP法。以PBS代替一抗设立空白对照，以已知乳腺癌阳性片作为阳性对照。结果判定：每张切片在光镜下随机选取5个视野。整合素β3和p-p38的每个视野计数100个瘤细胞，根据阳性细胞占全部肿瘤细胞的百分比分为：阳性细胞数＜50％为阴性（-）；阳性细胞数＞50％为阳性（+）。TN-c在细胞外基质中的阳性表达为基质呈断线状、连续线状或网状棕黄色着色。着色强度分为无色或浅黄色为阴性（-），黄色或棕黄色为阳性（+）。Western印迹法：RIPA buffer裂解液，超声处理，高速低温离心提取总蛋白，用Bradford法进行蛋白浓度测定。SDS-PAGE电泳，转印，封闭后加相应一抗、二抗及DAB显色，观察拍照，进行灰度值测定。4、统计学分析行χ2检验和Pearson相关分析。确定P＜0.05为差异有显著性。结果1、p-p38、整合素β3、TN-c在乳腺癌组织中的表达及相关性分析免疫组化结果显示，p-p38蛋白主要位于乳腺癌细胞核内，呈棕黄色颗粒，阳性率为57.50％（46／80）。整合素β3蛋白主要位于乳腺癌细胞浆内，呈棕黄色颗粒，阳性率为56.25％（45／80），而在正常乳腺中不表达；TN-c蛋白主要分布于细胞外基质中，呈断线状、连续线状或网状着色，阳性率为86.25％（69／80），在正常乳腺中，表达于基底膜。统计学分析显示，每两者之间表达分别存在正相关（r=0.584，P＜0.05；r=0.237，P＜0.05；r=0.293，P＜0.05）。2、乳腺癌组织中p-p38、整合素β3、TN-c表达与临床病理特征的关系p-p38、整合素β3及TN-c表达与乳腺癌淋巴结转移及临床分期有关（P＜0.05），而与患者的年龄、肿瘤大小无明显相关性（P＞0.05）。3、两种转移性不同的乳腺癌细胞中p-p38、整合素β3、TN-c的表达Western印迹法检测结果显示，高转移性的MDA-MB-231细胞中p-p38及整合素β3、TN-c表达水平高于低转移性的MCF-7细胞。MCF-7细胞中TN-c不表达。4、用anti-整合素β3和anti-TN-c抗体分别阻断MDA-MB-231细胞后p-p38蛋白表达的变化用20μg／ml的抑制性anti-整合素β3抗体及抑制性anti-TN-c抗体分别处理MDA-MB-231细胞24h后，用Western blot检测MDA-MB-231细胞中p-p38的表达量。结果显示，两种方法处理后的乳腺癌细胞MDA-MB-231的p-p38蛋白表达水平均下降。讨论MAPK（mitogen-activated protein kinase），即丝裂原活化蛋白激酶，是细胞内广泛存在的丝／苏氨酸蛋白激酶超家族，将细胞外信号传至细胞内，参与细胞的生长、分化、增殖的调节及恶性转化，与肿瘤的发生、发展有关。p38MAPK是MAPK家族的重要成员，多种炎症因子和生长因子及应激反应可使p38MAPK的酪氨酸和苏氨酸双磷酸化，从而激活p38MAPK，p38MAPK信号通路参与调节细胞生长、凋亡、运动及侵袭表型，在细胞迁移、肿瘤细胞侵袭转移方面具有重要的调控功能。整合素是一组二价离子依赖性表面糖蛋白，其功能在于与相应配体结合介导细胞与基底膜、细胞与细胞间的黏附，并通过传递特定信号或诱导基因的表达来控制细胞的存在或凋亡。TN是ECM中一种寡聚糖蛋白，是近年来发现的整合素的重要配体之一，具有独特的六臂体结构，其蛋白质序列中含有表皮生长因子（EGF）片段和Ⅲ型纤维连结蛋白片段。我们通过分析整合素β3和配体TN-c以及p-p38在乳腺癌组织内的共表达情况及其与临床病理学征象之间的关系发现，TN-c和整合素β3以及p-p38在乳腺癌组织中的表达明显高于正常乳腺组织。结合乳腺癌各种病理指标分析的结果显示，随着肿瘤恶性程度增高，TN-c和整合素β3以及p-p38表达也越强，但他们的表达与肿瘤直径、年龄无关。此外，在乳腺癌组织内，p-p38和整合素β3及其配体的表达具有相关性。我们又进一步在体外研究了乳腺癌细胞中p38MAPK信号通路与整合素β3及其配体TN-c表达的关系。Western印迹显示，抑制整合素β3及其配体TN-c均能够抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞p-p38表达，证明乳腺癌细胞中整合素β3对p38有调控作用。结论1、整合素β3、TN-c、p-p38表达与乳腺癌临床分期及淋巴结转移有关。2、整合素β3、TN-c和p-p38在乳腺癌中表达存在正相关。3、阻断整合素β3、TN-c后，乳腺癌细胞中p-p38表达下降。