论文摘要
一研究背景与目的脓毒症是由感染引起的全身炎症反应。脓毒症可以最终导致免疫功能的缺陷和多器官功能衰竭。近年来,胃肠道已经被认识到在脓毒症中的重要性。虽然以前胃肠道只是被认为在脓毒症发展过程中起很小的作用,但是现在认为胃肠道在脓毒症的发生发展过程中起到很重要的作用,特别是对于高代谢状态的维持。这是因为在脓毒症中胃肠道结构和功能的改变促使肠道屏障功能的缺失。小肠屏障包括免疫屏障和非免疫屏障。免疫屏障分为局部（肠系膜淋巴结,MLNs;肠上皮内淋巴细胞,TELs）和系统部分（循环系统淋巴细胞和脾内的淋巴细胞）。非免疫屏障分为物理屏障（健康的肠上皮细胞和紧密连接）,化学屏障和微生物屏障。小肠物理屏障的代表是小肠上皮。生理状态下,小肠上皮的结构和紧密连接只允许非常小的分子的通过,阻止细菌或者是大分子如,脂多糖的转移。正常状态下的小肠,吸收营养物质阻止细菌移位。脓毒症时,小肠的通透性改变,细菌过度生长,毒素产生增多,小肠不能阻止细菌浸润到肠系膜淋巴结和其他肠外器官（如,脾,肺,肝,血液）。这个过程称作细菌移位。增多细菌通过小肠上皮细胞层的穿细胞途径和细胞间途径的转移,已经被认为是对小肠粘膜的直接和间接损伤的表现。细胞间途径的细菌移位可以由肠道上皮细胞结构的改变引起,特别是紧密连接的改变。在人体内,如果只有通过肠腔移位到身体其他部位的细菌是不足够产生有害的作用的,移位细菌的存活才是必不可少的一个因素。宿主的免疫反应才是致病的重要因素。由于机体处于一种免疫抑制状态,脓毒症病人不能对于侵入的病原体产生足够的免疫反应。这种免疫抑制表现为脾和外周血T淋巴细胞增值减少。肠道的免疫系统含有全身大部分的免疫细胞,被认为是对于维持肠道的功能和粘膜的完整具有极其重要的作用。小肠的T淋巴细胞将近占全身T淋巴细胞总数的60%。T淋巴细胞增值抑制目前是脓毒症发生时的一个普遍发现,这种抑制可以发生在细菌移位道肠系膜淋巴结、脾和循环系统中。除了T淋巴细胞的增值抑制,T淋巴细胞提呈抗原肽给小肠和肠系膜淋巴结中的B和T细胞,被抗原提呈细胞刺激后,可以引发Th1免疫反应。Th1免疫反应主要分泌IFN—γ,可以激活巨噬细胞。与此同时,T淋巴细胞可以分泌IL-4,此成为Th2免疫反应,Th2免疫反应抑制Th1免疫反应。在脓毒症中,这种Th1/Th2的平衡和其他的控制机制有可能被破坏了,以致于产生不正常的炎症反应。脓毒症中细胞免疫的损害作用于肠道上皮组织,进一步的损伤屏障的功能增加肠道的通透性。这种方式下,一个恶性循环就产生了,屏障功能的损伤进一步的肠道通透性增加,因此引发免疫反应,而免疫反应可以反过来作用于肠道屏障促进进一步肠粘膜通透性的增加。脓毒症中一个普遍的并发症是胃肠道淤滞或者肠梗阻。脓毒症抑制胃肠运动。胃肠道中食物的储留可以引起细菌过度生长,导致细菌移位和多器官功能衰竭。这说明胃肠道的淤滞可以是脓毒症的结果但是也可以引起脓毒症,尤其是引起脓毒症的持续状态或者复发。微循环的功能障碍同样也在脓毒症的病理生理变化中起到关键的作用,引起组织缺氧和多器官功能障碍。脓毒症中内脏血流灌注不足和血流的重新分布会导致粘膜的缺氧。因为小肠粘膜绒毛的血管特殊逆流结构,这种结构为了保持粘膜功能的完整性对于氧和营养成份有广大的需要量,小肠粘膜对于灌注不足尤其易使粘膜受损。跟着发生肠道的缺血,因为粘膜屏障的损伤,引起细菌和毒素的移位导致脓毒症的状态的维持和成为脓毒症的始动器官。宿主防御细菌攻击的过程中,肥大细胞由于集中在特殊的位置,如粘膜表面,它的重要作用不容忽视。正常人肠道粘膜肥大细胞占有全身将近2%—3%的数量。肥大细胞可以摄入和清除诸如大肠杆菌类的抗原。细菌引起肥大细胞的脱颗粒。幽门螺旋杆菌感染时,在胃组织中可以观察到丰富的肥大细胞。因此,肠道肥大细胞活化在某种程度上属于生理反应但是可能对于宿主并不一直是恰当的或者有益的。最近,在脓毒症模型中发现肥大细胞在细菌感染的过程中被认为是有害的因素。另有研究者认为肥大细胞的二肽基肽酶Ⅰ（DPPⅠ）可以使脓毒症模型动物的死亡率升高。在肠道中,肥大细胞通过释放脂类介质和炎症因子,目前被认为可以调节肠道的功能,包括调节上皮屏障（物理屏障）,运动和内脏的敏感性。一氧化氮和大鼠肥大细胞蛋白酶Ⅱ（RMCPⅡ）被认为是与胃肠道有关的重要的肥大细胞的介质。RMCPⅡ是从肠道粘膜分离的一种可溶性大鼠肥大细胞糜蛋白酶,起初曾经被认为是细胞内组特异性蛋白酶,后来才被发现是由肥大细胞分泌的。有研究者用特异性抗体证明,大鼠粘膜含有可溶性β糜蛋白酶—RMCPⅡ,但是缺少不可溶性的β糜蛋白酶—RMCPⅠ。相反的是在结缔组织肥大细胞中含有RMCPⅠ而缺少RMCPⅡ。小鼠中的同源体,MMCPⅠ只表达在粘膜上皮中的肥大细胞中。类似的情况是,在普通的绵羊中,SMCP-Ⅰ,双特异性糜蛋白/纤溶酶表达在肠道的粘膜肥大细胞中,而不是相邻的粘膜下层的肥大细胞。因此在啮齿类和绵羊动物中,肠道粘膜肥大细胞具有特异性的蛋白水解酶表现型。因此RMCPⅡ被认为可以做为肠道肥大细胞脱颗粒的标志。生理状态下,肠道粘膜的结构型一氧化氮合酶（cNOS）产生少量的NO直接作用于相邻的细胞。这样的作用与胃肠道的防御机制有关。另一方面,脓毒症时可诱导性一氧化氮合酶持续产生大量的NO介导亚硝基化应激和氧化应激。这些应激反应会引起肠道粘膜的损伤。由于小肠对于脓毒症发生和发展起到非常重要的作用,所以小肠就目前成为一个新的治疗靶点。丙酮酸乙脂（ethyl pyruvate,EP）,一种稳定的丙酮酸盐衍生物,是一种实验性治疗药物。丙酮酸乙脂已经被证实可以改善肠系膜缺血再灌注,出血性休克,内毒素血症和细菌性脓毒症动物模型中的肠道,肾脏和肝脏的损伤。用丙酮酸乙脂治疗也可以改善在急性胰腺炎和酒精性肝炎小鼠模型中的器官功能损伤。在很多急性危重病模型中,用丙酮酸乙脂治疗可以下调不同的促炎基因的表达,包括iNOS,TNF-α,COX-2和IL-6。乌司他丁（ulinastatin,UTI）是从人的尿液中分离出来的分子量为24,000Da的糖蛋白。乌司他丁具有抗炎的作用和抑制中性粒细胞的浸润和中性粒细胞弹性蛋白酶的释放的作用。近年来的研究表明乌司他丁在缺血再灌注的肝脏、肾脏、心脏和肺脏的损伤中具有细胞保护作用。而且,乌司他丁还可以抑制脂多糖（LPS）刺激的人类单核细胞分泌的TNF-α,抑制脂多糖刺激的白介素（IL-8）基因在HL60细胞中的表达。丙酮酸乙脂和乌司他丁在脓毒症中对于小肠屏障（物理和免疫屏障）、运动功能和小肠粘膜微循环的作用及其作用机制很少有系统的研究。在本实验中,我们用盲肠结扎穿孔诱导的脓毒症模型,观察小肠屏障功能、运动功能和微循环的损伤以及丙酮酸乙脂和乌司他丁对他们的保护作用的研究。二研究对象和方法1实验动物分组:健康雄性成年Wistar大鼠120只,体重250g±12.7g,由山东大学动物试验中心提供,标准饲料,专人单笼饲养大鼠,明暗周期为12小时,饲养1周。试验前12小时禁食,自由饮水。由于脓毒症模型的高死亡率,随机分配脓毒症组（CLP）35只,丙酮酸乙脂组（EP）35只,乌司他丁组（UTI）35只,假手术组（sham）15只。EP手术后6小时腹腔给药,每6小时给一次,每次120mg/kg。UTI于手术后6小时腹腔给药,50,000U/kg/d。CLP组与sham组动物每次给予1.2 mL林格氏液。动物模型制备及标本收集:手术前12小时禁食不禁水,手术前腹腔注射1%戊巴比妥钠（50 mg/kg）麻醉,取仰卧位,75%酒精消毒腹部后铺洞巾,沿腹正中线做一长约1.5cm的切口,剪开皮肤和肌层,探查腹腔找到盲肠,避免损伤肠系膜血管。用4号丝线结扎盲肠末端1/3,用23号针穿刺两次形成2个盲肠漏,然后轻轻挤出少许粪便。将盲肠还纳腹腔,逐层缝合腹壁切口。Sham组给予相同的手术只是没有盲肠结扎穿孔过程。动物术后皮下注射生理盐水2—3 ml/kg,分笼喂养,观察大鼠一般情况及4天的生存率。术后每天从动物颈静脉取血1mL,1500r/min离心15分钟,取上清—20℃保存。术后4天,每一组存活的大鼠被活杀,心脏穿刺取血,1500r/min离心15分钟,取上清—20℃保存。打开腹腔后,无菌取肠系膜淋巴结（MLN）和脾放入含有冰PBS（pH7.4）的培养皿。分离小肠,距回盲部5cm取回肠,用冰盐水灌注清除小肠内容物,待检。2实验方法（1）各组生存率分析。（2）光学显微镜观察HE小肠切片:每只动物小肠切片中,任意选取20个光镜视野,小肠组织学结构变化根据Ozkan标准进行评分。①正常小肠粘膜;②小肠粘膜水肿变性,上皮细胞表面与固有层分离;③上皮细胞的坏死,局限在绒毛尖端。④完全的绒毛坏死;⑤粘膜全层的坏死。（3）电子显微镜观察小肠粘膜超微结构:紧密连接,微绒毛。（4）细菌移位:无菌采集肠系膜淋巴结和脾,匀浆后置于厌氧培养箱37℃培养24-48小时,计数细菌集落数。（5）流式细胞术测定T细胞亚群比例:对细胞表面抗原CD3、CD4、CD8阳性细胞进行标记,CD4/CD8 T细胞比值根据CD4+CD3+/CD8+CD3+计算。（6）免疫组织化学法对回肠组织粘膜CD4、CD8阳性细胞进行染色。（7）脾淋巴细胞增值实验:噻唑蓝（MTT）比色法检测脾淋巴细胞增殖反应。（8）ELISA法测定细胞因子IFN-γ、IL-4在脾淋巴细胞培养上清液中浓度。（9）小肠粘膜血流量的测定:用激光多普勒血流仪测定小肠粘膜的血流量。（10）小肠运动功能的测定:测定小肠内压力的变化。（11）电子显微镜观察肥大细胞超微结构变化。（12）ELISA法测定肠腔内的RMCPⅡ水平。（13）分光光度法测定小肠组织髓过氧化物酶（MPO）活性。（14）分光光度法测定小肠组织和血液中一氧化氮（NO）浓度。（15）RT-PCR半定量检测小肠iNOS mRNA的表达。3统计方法:用Kaplan-Meier和Log-Rank方法比较各组的生存率。各组小肠组织病理学结果用Kruskall Wallis方法分析。其他的结果用平均数±标准差（means+SEM）表示。数据用单因素方差分析（one-way ANOVA—Neuman-Keuls）。用SPSS15.0软件进行统计学分析。P＜0.05认为有统计学意义。三结果1存活率分析:Sham组未发现动物死亡,CLP组存活率37.1%,EP组存活率57.1%,UTI组存活率62.9%。2光镜观察小肠结构:CLP组的组织学评分显著高于sham组的评分（P＜0.001）。与CLP组相比,EP组和UTI组的组织学评分均较CLP组显著改善（P＜0.05）。3肠粘膜上皮细胞超微结构变化:Sham组大鼠回肠上皮细胞连接结构正常,只观察到很少的紧密连接增宽（3.5±1.9%）。CLP组发现很多紧密连接扩大（23±2.6%）。EP组和UTI组增大的紧密连接数量较CLP组大鼠有明显的减少（EP:16.5±3.4%,P＜0.05;UTI:13.5±3.4%.P＜0.01）。4细菌移位:在sham组没有观察到细菌移位。CLP组动物均发现细菌移位阳性结果（13/13）,而EP组发现16只细菌移位阳性结果（16/20）,UTI组发现17只细菌移位阳性结果（17/22）。与CLP组细菌移位集落数（26.0±10.1×103）相比,EP组发现的细菌移位集落数明显的减少（14.4±5.9×103CFUs,P＜0.05）。在UTI组发现细菌移位集落数也较CLP减少结果（13.1±4.0×103 CFUs,P＜0.01）。5流式细胞分析:CLP组CD4+T淋巴细胞所占的比例比sham组显著降低（在脾淋巴细胞中,P＜0.01;在MLN细胞中,P＜0.001）。在EP组,这种减少被显著的改善（在脾淋巴细胞中,P＜0.05;在MLN细胞中,P＜0.05）。三组中,在脾和MLN细胞中的CD8+T细胞所占的比值没有明显的改变。CLP组中,与sham组相比,CD4/CD8比值明显减少（在脾淋巴细胞中,P＜0.05;在MLN淋巴细胞中,P＜0.05）。在EP组,这种减少被明显改善（在脾淋巴细胞中,P＜0.05;在MLN细胞中,P＜0.05）。然而,在UTI组,上述未发现显著改善。6免疫组化:CLP组的上皮内CD8+T淋巴细胞比sham组显著增多（P＜0.05）。但是与CLP组相比,在EP组没有观察到CD8+T淋巴细胞的明显变化（P＞0.05）。在固有层,CLP组的CD4+T淋巴细胞比sham组显著减少（P＜0.01）。在EP组,与CLP组相比,CD4+T淋巴细胞的减少可以被明显的改善（P＜0.05）。在UTI组中,上皮层内,与CLP组相比,未发现CD8+T细胞的改善;固有层内,与CLP组相比,同样也未发现CD4+T细胞的改善。7脾淋巴细胞增值反应:与sham组相比,CLP组植物血凝素刺激的增值指数显著被抑制（CLP,5.3±1.7;sham,11.6±2.6;P＜0.01）。EP组中,这种抑制被显著改善（7.1±2.0,P＜0.05）。但是在UTI组中,没有发现这种改善（6.1±2.4,P＞0.05）。8细胞培养上清液中Th1/Th2细胞因子浓度测定:在植物血凝素（PHA）刺激的脾淋巴细胞培养上清液中,CLP组的IFN-γ浓度较sham组显著降低（CLP,1455.9±81.6 pg/ml;sham,1910.5±121.1 pg/ml;P＜0.001）。EP组,这种减少被显著改善（1705.6±128.3 pg/ml,P＜0.001）。而CLP组中IL-4浓度较sham组显著升高（CLP,115.3±18.9 pg/ml;sham,52.8±11.1 pg/ml;P＜0.001）。EP同样可以改变这种升高（86.4±17.2 pg/ml,与CLP组相比,P＜0.01）。UTI对于这两种细胞因子的改变与CLP组相比没有统计学意义（IFN-γ,1560.3±148.7:IL-4,102.2±28.3;P＞0.05）9小肠内压力测定:在sham组,小肠产生相对规则的大的位相性收缩,大的位相性收缩的频率是每分钟1.6±0.7次,小肠内压力的振幅为11.2±3.7 mmHg。与sham组相比,CLP组小肠的收缩的振幅明显的降低（4.6±2.3 mmHg,P＜0.01）,收缩的频率也明显的减少（每分钟0.7±0.2次,P＜0.01）。EP组和UTI组小肠的收缩的振幅和收缩频率明显改善。振幅分别为EP组8.1±2.6 mmHg（P＜0.05）,UTI组9.0±2.5 mmHg（P＜0.05）;频率分别为EP组1.4±0.5次（P＜0.05）,UTI组1.5±0.4次（P＜0.01）。10小肠粘膜的微循环血流量:与sham组相比,CLP组观察到小肠粘膜的血流减少（CLP组,158.6±42.9 PU;sham组,269.9±34.3PU;P＜0.001）。EP和UTI都可以明显改善这种情况（EP组,199.5±36.8 PU,P＜0.01:UTI组,230.8±51.9 PU,P＜0.001）。11.肥大细胞超微结构:与sham组（6.3±4.8%）相比,CLP组的脱颗粒的肥大细胞数量比例显著增多（32.5±6.4%,P＜0.01）。与CLP组相比,UTI组脱颗粒的肥大细胞数量显著减少（21.3±4.8%,P＜0.05,）;EP组,未发现脱颗粒的肥大细胞数量明显减少（28.7±4.9%,P＞0.05）。12肠腔中RMCPⅡ浓度:与sham组相比,CLP组中的肠腔内RMCPⅡ浓度显著增高（CLP组,28.6±7.8 ng/ml:sham组,0.9±0.2ng/ml;P＜0.001）。UTI组的浓度较CLP组的浓度显著降低（16.5±5.4ng/ml,P＜0.05）。EP组未发现显著变化（22.7±7.9 ng/ml,P＞0.05）。13小肠组织中髓过氧化物酶（MPO）表达:Sham组中,MPO活性表达为:2.1±1.9 U/g tissue。CLP组中,小肠组织MPO显著高表达（12.9±6.2 U/g tissue,P＜0.001）。EP和UTI可以抑制MPO高表达（EP,8.6±4.4 U/g tissue,P＜0.05;UTI,6.4±4.5 U/g,P＜0.01）14一氧化氮（NOx）在血清和小肠中的浓度:在CLP组中,NO随着时间而增高。sham组的浓度在4天中一直无明显变化,CLP组在4天中持续升高（第4天时,322.2±42.1μmol/L）。EP和UTI治疗组的浓度较CLP组显著下降（EP组,249.7±41.6μmol/L,P＜0.05:UTI组,236.2±31.3μmol/L,P＜0.01）。小肠组织中的NO浓度比sham组显著升高（CLP组,63.5±11.4 nmol/g tissue;sham组,20.3±5.1 nmol/gtissue;P＜0.001）。EP和UTI同样可以显著降低小肠组织中NO的浓度（EP,46.1±9.8,P＜0.01;UTI,43.3±12.7,P＜0.01）15小肠组织中iNOS mRNA表达:Sham组,没有检测到iNOS mRNA表达。CLP组iNOS/β-actin比值显著升高（0.62±0.13,P＜0.001）,EP和UTI治疗组中iNOS/β-actin值显著降低,分别为EP组为0.37±0.11,P＜0.01;UTI组为0.33±0.17,P＜0.01。四结论及意义1本实验采用盲肠结扎穿孔术建立脓毒症大鼠模型,观察到在脓毒症大鼠中,小肠的物理屏障和免疫屏障、小肠的运动和小肠粘膜微循环均有损伤,小肠组织中的肥大细胞发生活化,及血液中和小肠组织中NO浓度,小肠组织中MPO活性和iNOS mRNA表达增高。2丙酮酸乙脂和乌司他丁治疗干预均发现对于脓毒症大鼠小肠的保护作用,表现为小肠的屏障功能都得到了改善,但是这两种药物的作用机制却不完全相同。（1）丙酮酸乙脂减少脓毒症大鼠细菌移位的发生,提高生存率。保护小肠的物理屏障和免疫屏障,尤其是免疫屏障,不仅增加CD4+T淋巴细胞在肠系膜淋巴结和小肠组织中的数量,还可以维持Th1/Th2细胞因子分泌的平衡。并可以抑制血液和小肠组织中NO水平的升高,抑制小肠组织中MPO活性和iNOS mRNA的表达,改善小肠运动和小肠粘膜的血流,但不能抑制小肠粘膜肥大细胞的活化。（2）乌司他丁也可以减少脓毒症大鼠细菌移位的发生,提高生存率。同样保护小肠的物理屏障,改善小肠的运动和粘膜微循环,抑制血液和小肠组织中NO水平的升高,抑制小肠组织中MPO活性和iNOSmRNA的表达,对于小肠的免疫屏障没有保护作用,但乌司他丁可以抑制小肠粘膜肥大细胞的活化,这或许是其发挥上述作用的重要机制。
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