针对阿尔茨海默病中Aβ42靶点的抗体与天然药物的效应分析

论文摘要

阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease, AD）,俗称老年痴呆症,是一种较常见的神经退行性疾病,老年斑、神经纤维缠结、神经细胞凋亡是其三大病理学特征。越来越的证据表明：β-淀粉样肽（p-amyloid peptide, Aβ42）的大量产生和聚集是导致AD发生、发展的根本原因。大量的研究证明,Aβ42寡聚体是最具神经细胞毒性的形式。Aβ42在体内由淀粉样前体蛋白（amyloid precursor protein, APP）经β-分泌酶和γ-分泌酶顺次剪切产生的,即β-分泌酶剪切APP产生C99,γ-分泌酶再剪切C99产生Aβ42。本论文分别针对Aβ42寡聚体的细胞毒性和针对γ-分泌酶的催化组分PS1与C99相互作用两个重要环节对抗Aβ42的抗体和天然药物组分进行了研究。一、针对Aβ42寡聚体靶点的抗Aβ42抗体的效应分析一直以来困扰AD免疫治疗的主要问题是疫苗或抗体的安全性。在前期研究中,我们设计合成了多种Aβ42相关抗原蛋白,并获得了相应的抗Aβ42的系列抗体,其中抗原GST-I-Ap28和GST-Ap42诱导了最强的抗Aβ42的免疫反应,抗体滴度达到1：3200,这两种抗体在抑制和中和Aβ42细胞毒性方面也显示了最强的功效,并且透射电镜观察发现它们能够有效抑制、逆转Aβ42的纤维化。在本论文中：（1）分析了抗原GST-I-Ap28, GST-Ap42诱导的抗Aβ42抗体的亚型,结果发现：GST-I-Aβ28诱导的抗体主要为IgG1和IgG2b亚型,而GST-Aβ42诱导的抗体则主要为IgG2b和IgG2a亚型,这表明GST-I-Ap28主要诱导产生了Th2类免疫反应,而GST-Aβ42则主要诱导产生了Th1类免疫反应。上述结果表明了GST-I-Ap28作为免疫原的安全性。（2）分析了上述两种抗体对Aβ42不同聚集形式的识别特异性,结果显示：两者对Aβ42单体和Aβ42寡聚体的识别能力均高于对Aβ42原纤维和Aβ42纤维的识别。上述结果表明了GST-I-Ap28诱导抗体识别Aβ42寡聚体的有效性。（3）分析了上述两种抗体对转染了APP的靶细胞在Aβ42寡聚体基质上粘附的影响,结果显示：两种抗体均能有效抑制靶细胞在Aβ42基质上的粘附。最近有研究结果显示：Aβ42寡聚体可能是通过与细胞表面APP分子的相互作用,加速APP二聚化,导致APP的胞内区段被caspase 8水解产生具有潜在毒性的C31片段,引发神经细胞凋亡。上述结果显示：本论文分析的抗体可能是通过与Aβ42以及Aβ42的前体蛋白（如APP.C99）分子中的Aβ42区结合,从而阻碍了Aβ42与APP的相互作用,抑制了APP介导的Aβ42毒性通路。二、针对Aβ42寡聚体靶点的天然药物效应分析天然药物在AD治疗的研究中日益被重视。本论文选择了20种传统中药人参、枸杞、银杏、川芎、刺五加、五味子、母菊、丹参、蒲公英、丹皮、桃仁、红花、三七、生地、熟地、马齿苋、丹皮、赤芍、黄芪、远志、茯苓作为目标中药,提取了天然药物组分,针对Aβ42靶点,以PC12细胞为靶细胞,对这些天然药物的效应进行了分析：（1）通过MTT法检测这20种天然药物提取物对Aβ42细胞毒性的抑制和中和作用,结果发现：银杏、枸杞、母菊、远志等四种天然药物的提取物的作用显著。进一步研究确定了银杏黄酮、枸杞多糖、母菊内酯、母菊黄酮、远志皂甙等5种先导化合物为有效的天然药物成分,其中母菊内酯、母菊黄酮在抑制和中和Aβ42细胞毒性方面的作用最强。（2）通过透射电子显微镜观察发现：母菊内酯、母菊黄酮具有抑制、逆转Aβ纤维化的作用。（3）分析了母菊内酯、母菊黄酮对转染了APP的靶细胞在Aβ42寡聚体基质上粘附的影响,结果显示：两者均能有效抑制靶细胞在Aβ42基质上的粘附。（4）进一步通过细胞粘附实验分析了母菊黄酮、母菊内酯对转染了γ-分泌酶催化组分PS1及其N-、C-片段（PSl-F、PSl-N、PSl-C）的COS-7细胞在C99基质上的粘附的影响,并通过免疫共沉淀实验分析了母菊黄酮、母菊内酯对PS1和C99相互作用的影响。上述分析均以PS1的另一种重要底物NOTCH△E （Notch的β-分泌酶剪切产物）为对照。研究结果显示：母菊黄酮、母菊内酯抑制了转染了PS1的靶细胞COS-7在C99基质上的粘附,同时也抑制了PS1与C99的相互作用,但对PS1与NOTCH△E的相互作用无明显影响。综上所述,由于母菊黄酮、母菊内酯表现出的一系列与抗Aβ42抗体类似的功效,推测它们可能是通过与C99分子中的Aβ42区域特异性结合,从而特异性抑制PS1和C99的相互作用。上述结果表明母菊内酯、母菊黄酮在针对Aβ42寡聚体的细胞毒性和针对PS1与C99相互作用两个重要环节上均具有显著的功效。本论文的研究结果为防治AD的抗体或天然药物的应用研究和药物制备提供了理论指导。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
• 1.1 Aβ级联假说
• 1.1.1 Aβ的产生及其前体蛋白
• 1.1.2 Aβ42的毒性
• 1.2 AD的免疫治疗
• 1.3 γ-分泌酶抑制剂在AD治疗中的作用
• 1.3.1 γ-分泌酶的研究进展
• 1.3.2 γ-分泌酶抑制剂的研究进展
• 1.4 天然药物在AD治疗中的研究
• 第2章 针对Aβ42寡聚体靶点的抗Aβ42抗体的效应分析
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌种和质粒及实验动物
• 2.1.2 生物试剂、抗体
• 2.1.3 细胞株及细胞培养相关试剂
• 2.1.4 主要仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 抗体的制备
• 2.2.2 抗体亚型的测定
• 2.2.3 Aβ42不同聚集形式的的制备及观察
• 2.2.4 抗体对不同聚集形式的Aβ42识别特异性差异的检测
• 2.2.5 转染
• 2.2.6 MTT法检测细胞活力
• 2.2.7 抗体对转染了APP的细胞在Aβ42基质上粘附的影响
• 2.3 实验结果
• 2.3.1 抗Aβ42抗体的亚型分析
• 2.3.2 抗体对Aβ42不同聚集形式的识别特异性分析
• 2.3.3 抗体对转染了APP的细胞在Aβ42寡聚体基质上粘附的影响
• 2.4 本章小结
• 第3章 针对Aβ42寡聚体靶点的天然药物效应分析
• 3.1 实验材料与仪器
• 3.1.1 载体质粒、菌株、细胞系
• 3.1.2 工具酶
• 3.1.3 主要试剂
• 3.1.4 天然药物材及天然药物组分
• 3.1.5 抗体及转染试剂
• 3.1.6 高粘性96孔板
• 3.1.7 主要实验设备
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 质粒的提取与纯化
• 3.2.2 DNA的定量测定
• 3.2.3 总RNA的提取与反转录
• 3.2.4 引物设计
• 3.2.5 目的片段的扩增
• 3.2.6 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 3.2.7 质粒的转化
• 3.2.8 限制性内切酶酶切反应
• 3.2.9 DNA鉴定、分离与回收
• 3.2.10 外源DNA片段与质粒载体的连接反应
• 3.2.11 阳性菌株筛选及菌落PCR鉴定
• 3.2.12 阳性菌株的酶切鉴定
• 3.2.13 重组蛋白的诱导表达
• 3.2.14 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）
• 3.2.15 表达菌体的裂解
• 3.2.16 蛋白印迹（Western blotting）检测
• 3.3.17 目的蛋白表达水平分析
• 3.2.18 天然药物提取物的制备
• 3.2.19 PC12细胞培养
• 3.2.20 MTT实验分组
• 3.2.21 MTT法检测天然药物提取物对Aβ42神经毒性的影响
• 3.2.22 MTT法检测单体化合物对Aβ42的神经毒性的影响
• 3.2.23 细胞爬片
• 3.2.24 免疫荧光
• 3.2.25 电镜观察单体化合物对Aβ42纤维化的抑制作用
• 3.2.26 单体化合物对转染了APP的靶细胞在Aβ42基质上粘附的影响
• 3.2.27 细胞裂解
• 3.2.28 单体化合物对转染了PS1的靶细胞在C99、Notch△E基质上粘附的影响
• 3.2.29 免疫共沉淀（co-immunoprecipitation,co-IP）
• 3.2.30 单体化合物对PS1和C99（或Notch△E）相互作用的影响
• 3.3 实验结果
• 3.3.1 表达载体的构建
• 3.3.2 阳性克隆的鉴定
• 3.3.2.1 PEGFP-C3-PS1F、PEGFP-C3-PS1N、PEGFP-C3-PS1C阳性克隆的鉴定
• 3.3.2.2 pET28a-C99、pcDNA3.1-C99阳性克隆的鉴定
• 3.3.2.3 pcDNA3.1-Notch△E、pET28a-Notch△E阳性克隆的鉴定
• 3.3.3 C99、Notch△E的表达与纯化
• 3.3.3.1 PET-28A-C99的表达与纯化
• 3.3.3.2 PET-28A-NOTCH△E的表达与纯化
• 3.3.4 天然药物提取物的获得
• 3.3.5 天然药物提取物对Aβ42诱导的神经毒性的抑制作用
• 3.3.6 天然药物提取物对Aβ42诱导的神经毒性的中和作用
• 3.3.7 单体化合物对Aβ42诱导的神经毒性的抑制作用
• 3.3.8 单体化合物对Aβ42诱导的细胞毒性的中和作用
• 3.3.9 母菊内酯、母菊黄酮对Aβ42纤维化的影响
• 3.3.10 母菊内酯、母菊黄酮抑制转染了APP的靶细胞在Aβ42基质上的粘附
• 3.3.11 目的蛋白在COS-7细胞中的表达及定位
• 3.3.11.1 PS1-F、PS1-N、PS1-C在COS-7细胞中的表达和定位
• 3.3.11.2 C99、Notch△E在COS-7细胞中的表达和定位
• 3.3.12 母菊内酯、母菊黄酮抑制转染了PS1的靶细胞在C99、Notch△E基质上的粘附
• 3.3.13 母菊内酯、母菊黄酮对PS1与C99或Notch△E结合性的影响
• 3.4 本章小结
• 全文结论
• 本文创新点
• 参考文献
• 博士期间发表的学术论文及其他科研成果
• 致谢