蛋氨酸对抗和保护化疗药物引起的内耳毛细胞损伤和死亡作用的研究

论文摘要

目的:内耳前庭终器是感受机体平衡的重要器官之一。许多累及内耳的疾病往往在引起耳聋的同时还常常伴有前庭系统的损害,诸如氨基糖甙类抗生素,多种抗肿瘤化学制剂,以及各种神经毒素等都对耳蜗和前庭具有一定的损害作用。大量的动物和临床实验表明,抗癌药物卡铂、顺铂等可引起内耳毛细胞的损伤,造成病人听力损失,形成耳聋和耳鸣;也可以造成前庭毛细胞损伤,引起病人平衡失调,导致病人眩晕并丧失行动能力。而内耳前庭感觉终器是机体负责平衡的重要感觉器官,且内耳毛细胞死亡之后不可再生。因此如何保护内耳毛细胞免受耳毒性药物的侵害是一个关键,这引起了越来越多的耳鼻咽喉科医师的关注。蛋氨酸是含硫必需氨基酸,其在动物体内主要是用于蛋白质的合成,蛋氨酸还可利用其所带的甲基,对有毒物或药物进行甲基化而起到解毒的作用。其对耳蜗毛细胞损伤的保护作用已有实验报道。然而,迄今为止尚没有将蛋氨酸用于保护内耳前庭终器病变损伤的报道。本研究目的是通过给昆明小鼠腹腔注射卡铂,形成卡铂耳毒性的动物模型,然后给予蛋氨酸腹腔注射,从显微和超微结构等方面观察蛋氨酸对内耳毛细胞的保护作用。从而为开发新的保护内耳前庭感觉终器中毛细胞的药物提供实验室依据,为抗癌药导致的耳毒性的治疗提供新的思路。方法:采用光镜、扫描电镜、毛细胞计数等方法,观察蛋氨酸对卡铂引起的内耳毛细胞损伤的保护作用。具体步骤如下:1.实验分组及模型制作:将16只昆明小鼠随机分为4组,每组4只（n=4）,给予相应的处理:正常组:不给予致聋（A）;实验组:致聋后给予蛋氨酸干预（卡铂50mg/Kg,连续腹腔注射14天;蛋氨酸3.96mg/Kg,连续腹腔注射14天）（B）;实验对照组1:致聋后不给予蛋氨酸干预,给予同量生理盐水腹腔注射（卡铂50mg/Kg,连续腹腔注射14天;生理盐水3.96mg/Kg,连续腹腔注射14天）（C）;实验对照组2:致聋后不给予蛋氨酸干预,也不给予生理盐水腹腔注射（卡铂50mg/Kg,连续腹腔注射14天）（D）。然后小鼠在戊巴比妥那麻醉（50mg/Kg）下断头取出耳蜗,将标本在显微镜下进行解剖、染色、铺片等处理后,进行光镜及扫描电镜观察。2.标本的制作及观察2.1光镜标本制作及观察:将取材的听泡在蜗尖处钻孔,并打开蜗窗和前庭窗,从蜗尖小孔注入0.5%硝酸银溶液灌注染色,灌流3-5次,然后用10%福尔马林溶液灌流,灌流3-5次,然后浸入4℃10%福尔马林溶液固定6小时。按传统耳蜗基底膜软铺片术铺片。用游丝镊完整取出椭圆囊、球囊,分离出椭圆囊斑、球囊斑,并揭除其上的耳石膜,找到骨半规管,用游丝镊完整取出膜半规管内的壶腹嵴,揭除其上的耳石膜,都铺放在载玻片上的甘油滴中,盖上盖玻片,周围用中性树胶封固。普通光学显微镜（放大400倍）下观察。2.2扫描电镜标本制作及观察:将取材的听泡在蜗尖处钻孔,打开蜗窗和前庭窗,从蜗尖小孔注入4℃,2.5%的戊二醛固定液,灌流3-5次,并浸入戊二醛固定液,在4℃冰箱内固定4小时以上,然后置于EDTA（乙二胺四乙酸钠盐溶液,0.35mol/L,pH7.4）溶液中固定24小时,用洗涤液充分漂洗颞骨组织,并在解剖显微镜下剥离取出内耳膜迷路。用游丝镊摘除盖膜以暴露基底膜,分离针挑除耳石膜以暴露囊斑,用0.1mol/L磷酸盐缓冲液向壶腹内灌流以冲掉覆盖在嵴顶部的终帽。然后经固定、脱水、干燥、镀金等处理后,在扫描电镜下观察。3.统计学处理:采用SAS8.0统计软件进行实验数据处理,所有计量资料数据以（X±S）表示,计量资料先行正态性和方差齐性检验,再运用完全随机单因素方差分析、最小显著差异法（LSD-t）检验处理数据。以P<0.05为差异有统计学意义。结果:1各组基底膜内、外毛细胞数量比较:首先应用多样本正态性检验和方差齐性检验,证明三组内毛细胞数量和外毛细胞数量均服从正态分布,且数据方差齐,可以做方差分析。然后应用单因素方差分析,内毛细胞各组间差异有统计学意义（F=128.55,P=0.000）,两两比较采用最小显著差异法（LSD-t）检验,B、C、D组与A组的差异均有统计学意义（P值均小于0.01）。C、D组与B组的差异也都有统计学意义（P值均小于0.01）。C、D组差异不显著（P>0.05）。外毛细胞各组间差异有统计学意义（ F=55.84 ,P=0.000）,两两比较采用最小显著差异法（LSD-t）检验,B、C、D组与A组的差异均有统计学意义（P值均小于0.01）。C、D组与B组的差异也都有统计学意义（P值均小于0.01）。C、D组差异不显著（P>0.05）。2光镜观察:正常对照组动物耳蜗内、外毛细胞排列整齐,结构清晰,无变性、损坏。应用卡铂处理后的B、C、D三组的动物耳蜗有不同程度的坏死、脱落,尤以内毛细胞缺失严重,而外毛细胞缺失较少。应用蛋氨酸保护的B组动物耳蜗毛细胞较未用蛋氨酸保护的C、D组动物耳蜗毛细胞损伤较轻。球囊斑、椭圆囊斑、壶腹嵴的铺片显示正常对照组的毛细胞均匀排布,并且密度很高,而应用卡铂处理后的B、C、D三组的动物其毛细胞分布密度减低,且未应用蛋氨酸保护组的C、D组动物毛细胞减少明显,并且排布不均匀。在球囊斑和椭圆囊斑,毛细胞缺失主要发生在微纹区,而周边区毛细胞的损失相对较少,而壶腹嵴上毛细胞的缺失主要表现为嵴顶部有较多的Ⅰ型毛细胞缺损,Ⅱ型毛细胞的数量无明显改变。但B组椭圆囊斑毛细胞的缺失与C、D两组比较,无明显改变。3扫描电镜观察:对照组动物内、外毛细胞排列整齐,无倒伏、散乱、肿胀、粘连、脱失等现象,内毛细胞的纤毛呈直立簇状排列,三排外毛细胞的纤毛呈“V”型排列。应用卡铂处理后的B、C、D三组的动物基底膜上的毛细胞均有不同程度的纤毛肿胀、倒伏、散乱、脱失等,但外毛细胞较内毛细胞损伤较轻。应用蛋氨酸保护后的B组动物基底膜上的纤毛损伤情况较未用蛋氨酸的C、D组较轻。正常对照组动物球囊斑、椭圆囊斑、壶腹嵴上的毛细胞排列紧密,分布均匀,无倒伏、毛束紊乱、极性消失等。B、C、D三组应用卡铂处理后的动物前庭毛细胞均有不同程度的损伤,且未应用蛋氨酸保护的C、D组动物球囊斑和壶腹嵴毛细胞的损伤较B组严重。但B组应用蛋氨酸的小鼠其椭圆囊斑上的毛细胞,与C、D两组比较,无明显修复。结论:通过对小鼠应用卡铂药物后,我们观察发现小鼠基底膜上的内、外毛细胞均有散乱、倒伏、缺失等现象,球囊斑、椭圆囊斑和壶腹嵴上的纤毛也有倒伏、脱落、极性消失等现象,证明卡铂对小鼠的内耳毛细胞和前庭终器均有毒性作用,即可引起听力丧失、耳鸣和/或眩晕等症状。在应用卡铂之后又给予蛋氨酸的小鼠,与未应用蛋氨酸的小鼠相比,其内、外毛细胞及前庭终器上的毛细胞的损伤情况均较轻,证明应用蛋氨酸后,原来卡铂导致的毛细胞损伤有一定的恢复。因此,可以推知,卡铂导致的听力下降、耳鸣及眩晕等症状会有一定的恢复,即蛋氨酸在治疗卡铂导致的耳毒性方面起作用。这为开发保护内耳前庭感觉终器中毛细胞的药物提供了实验室依据,为抗癌药导致的耳毒性的治疗提供了新的思路。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 附表
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述 Connexi1126 与遗传性非综合征性耳聋的相关性研究
• 致谢
• 个人简历