腐胺对棉铃虫生长发育的影响及ODC基因片段的克隆

论文摘要

多胺（Polyamines,PA）如腐胺（putrescine,put）、亚精胺（spermidine,spd）及精胺（spermine,spm）是一类带正电荷的小分子脂肪族化合物,广泛存在于原核和真核细胞内。目前的研究表明,多胺对生物大分子的合成,细胞的生长、分化及蛋白质的生物合成有重要的调节作用,可参与昆虫的生长发育等多种生理过程。鸟氨酸脱羧酶（Ornithine decarboxylase,ODC,EC4.1.1.17）是一种磷酸吡哆醛依赖性酶,广泛存在于动物组织细胞,可催化鸟氨酸脱羧反应,鸟氨酸脱羧是腐胺产生的唯一途径,腐胺在丙胺转移酶的作用下,形成亚精胺继而形成精胺,ODC是该过程的限速酶。由于昆虫生理过程及多胺代谢过程的复杂性,多胺对昆虫生理过程的调节机理还不清楚,关于ODC与昆虫的关系研究国内还未见报道,国外也处于研究的初始阶段。因此,开展多胺对棉铃虫Helicoverpa armigera生长发育及卵黄蛋白合成的影响,对于进一步明确多胺生理功能,阐明多胺参与昆虫生理过程的机理具有重要意义。本文以棉铃虫为研究对象,在研究腐胺对棉铃虫的生长发育的基础上,采用高效液相色谱和酶联免疫技术分析了多胺对其体内多胺代谢及棉铃虫卵黄原蛋白合成的影响,同时利用RT-PCR技术克隆得到了棉铃虫的ODC基因片段。这项研究将为进一步了解多胺在昆虫体内的生理功能、阐明多胺在棉铃虫卵黄原蛋白合成过程中的生理功能及研究多胺在昆虫生理过程中的分子机制提供重要的理论基础。主要研究结果如下:1腐胺对棉铃虫生长发育的影响在实验室条件下研究了外源腐胺处理后对棉铃虫幼虫的发育历期、蛹重、成虫羽化率及畸形率的影响。结果表明:腐胺对棉铃虫幼虫及蛹的发育历期均有显著的影响。与对照组相比,经腐胺处理后,棉铃虫的幼虫历期均有不同程度的延长,其中经0.01%Put处理的棉铃虫幼虫历期最长,达到17.72±0.04d,与对照11.88±0.08d相比达到极显著差异,随着腐胺浓度的增加,棉铃虫幼虫历期呈逐渐下降趋势;0.1%Put和0.05%Put处理组棉铃虫的蛹期极显著短于0.01%处理组,0.5%Put组显著短于0.1%Put处理组,但0.01%Put处理组、0.5%Put处理组和对照组之间并无显著差异;与对照组相比,经腐胺处理后,棉铃虫的蛹重均有不同程度的增加,其中0.01%Put处理后的效应最明显,极显著大于其他处理组及对照,达到0.2806±0.0032g,而其他处理组之间及与对照之间均无显著差异;与对照组相比,经腐胺处理后,棉铃虫的蛹和成虫畸形率明显增大,其中蛹的畸形率变化表现为中间浓度腐胺处理组的较高,高浓度和低浓度腐胺处理后蛹的畸形率相对较低;而棉铃虫的成虫畸形率变化则表现为随腐胺处理浓度的增加而降低的趋势;与对照相比,2腐胺对棉铃虫产卵量的影响实验结果表明,经过腐胺处理后,棉铃虫的总产卵量与对照相比均没有显著差异,但是0.01%put处理的棉铃虫平均产卵量最高,达到1001.9±63.1粒/雌,0.5%Put浓度的腐胺处理的棉铃虫总产卵量最少,表明在本实验范围内,低浓度的腐胺（0.01%Put）能提高棉铃虫的产卵量,而高浓度的腐胺（0.5%Put）则对棉铃虫的产卵具有抑制作用;经过0.05%浓度的腐胺持续饲喂棉铃虫多代后,第1代棉铃虫平均总产卵量与对照相比,无显著变化;而经0.05%Put持续处理的第2代棉铃虫平均产卵量急剧下降,仅有498粒/雌,极显著低于对照,经0.5%Put持续处理的第3代和第4代棉铃虫的平均产卵量又有回升,但与对照相比无显著差异。结果表明,腐胺对棉铃虫的产卵量存在一定程度的影响。3腐胺对棉铃虫体内各组织多胺含量的影响研究发现在棉铃虫幼虫期体内腐胺和亚精胺含量一直处于较高的水平,且各期含量变化较大,而精胺一直处于较低的水平,动态变化幅度不大（资料未显示）;经低浓度腐胺处理后,棉铃虫各组织内两种多胺（put和spd）含量均有不同程度的改变,而高浓度的腐胺则对棉铃虫体内各组织多胺含量无明显的影响。经外源腐胺持续处理后,棉铃虫幼虫体内各组织两种主要多胺含量均受到明显的影响,特别是经外源腐胺处理的第4代棉铃虫,其主要多胺的含量变化与对照相比存在极显著的差异。4腐胺对棉铃虫卵黄蛋白合成的影响经过SDS-PAGE电泳,鉴定出棉铃虫卵黄磷蛋白由一条重链和一条轻链组成,重链分子量为165KD,轻链分子量为50KD;酶联免疫测定的结果表明,不同浓度的腐胺对棉铃虫的卵黄蛋白合成具有一定程度的影响,经0.1%Put和0.05%Put明显促进了棉铃虫血淋巴内卵黄蛋白合成,在大部分发育阶段,棉铃虫血淋巴内卵黄蛋白含量均高于对照,且峰值提前;而0.01%Put和0.5%Put明显抑制了棉铃虫卵黄蛋白的合成,在大部分发育阶段处理组体内卵黄蛋白含量均低于对照,在棉铃虫羽化36h以后,低浓度腐胺处理的棉铃虫卵黄蛋白含量下降较缓,而高浓度的腐胺处理的棉铃虫卵黄蛋白含量则急剧下降。5棉铃虫鸟氨酸脱羧酶基因片段的克隆根据已知ODC基因的保守序列设计简并引物,利用RT-PCR的方法克隆获得了与目的片段大小相似的条带,获得了棉铃虫ODC基因的EST片段。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1 多胺
• 1.1 多胺简介
• 1.2 多胺的生物合成与代谢
• 1.3 多胺的生物学作用
• 1.4 多胺与昆虫的关系
• 2 鸟氨酸脱羧酶
• 2.1 鸟氨酸脱羧酶生物学特性
• 2.2 鸟氨酸脱羧酶的生物学作用
• 3 鸟氨酸脱羧酶基因片段的克隆
• 3.1 依据序列同源性克隆基因
• 3.2 PCR扩增克隆基因
• 3.3 RACE技术
• 3.4 功能克隆
• 4 结语
• 第二章 多胺对棉铃虫生长发育的影响
• 1 材料与方法
• 1.1 供试昆虫
• 1.2 研究方法
• 1.3 数据分析
• 2 结果与分析
• 2.1 腐胺对棉铃虫幼虫和蛹发育历期影响
• 2.2 腐胺对棉铃虫蛹重、蛹畸形率和及成虫畸形率的影响
• 2.3 腐胺对棉铃虫产卵量的影响
• 2.4 0.05%腐胺持续饲喂对棉铃虫幼虫历期和蛹重的影响
• 2.5 0.05%腐胺持续饲喂对棉铃虫产卵量的影响
• 3 讨论
• 第三章 外源腐胺对棉铃虫体内主要多胺含量的影响
• 1 材料与方法
• 1.1 供试昆虫
• 1.2 昆虫组织待测样品预处理
• 1.3 待测样品处理
• 1.4 高效液相色谱条件
• 1.5 多胺标准曲线制作
• 1.6 组织样品蛋白含量测定
• 1.7 分析方法
• 2 结果与分析
• 2.1 多胺含量的标准曲线
• 2.2 腐胺处理后棉铃虫各组织多胺含量的动态变化
• 2.3 0.05%腐胺持续处理后各代棉铃虫各组织多胺含量的动态变化
• 3 讨论
• 第四章 多胺对昆虫卵黄蛋白合成的影响
• 1 材料与方法
• 1.1 供试昆虫
• 1.2 样品制备
• 1.3 卵黄蛋白的提取和纯化
• 1.4 卵黄蛋白电泳检测
• 1.5 卵黄蛋白抗血清的制备
• 1.6 卵黄蛋白抗血清效价的测定
• 1.7 卵黄蛋白含量的PAS-ELISA的测定
• 2 结果与分析
• 2.1 卵黄蛋白纯度的PAGE电泳和SDS-PAGE电泳检测
• 2.2 卵黄蛋白抗血清效价的测定
• 2.3 腐胺处理后棉铃虫血淋巴内卵黄蛋白含量的变化趋势
• 2.4 腐胺处理后棉铃虫成虫卵巢内卵黄蛋白含量的变化趋势
• 3 讨论
• 第五章 棉铃虫鸟氨酸脱羧酶基因片段的克隆
• 1 材料与方法
• 1.1 供试昆虫
• 1.2 试验方法
• 1.3 棉铃虫总RNA质量检测
• 1.4 棉铃虫鸟氨酸脱羧酶基因cDNA片段的扩增
• 2 结果与分析
• 2.1 总RNA提取
• 2.2 已知物种鸟氨酸脱羧酶基因序列信息的查找
• 2.3 多个物种鸟氨酸脱羧酶基因及其编码蛋白质序列的同源性比对
• 2.4 同源简并引物的获得
• 2.5 RT-PCR扩增结果
• 3 讨论
• 3.1 RNA的提取
• 3.2 简并引物的设计及RT-PCR反应条件的摸索
• 参考文献（REFERENCES）
• 致谢
• 硕士阶段发表学术论文