EGCG对阿尔茨海默病小鼠的保护作用及其可能机制

论文摘要

目的阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）是一种发生于中老年的以进行性认知障碍和记忆能力下降为主的退行性神经病变。其典型的病理改变是神经细胞间出现大量以β-淀粉样肽（β-Amyloid,Aβ）为核心的老年斑（senileplaques,SP）、神经元的胞体中出现神经原纤维缠结（neurofibrillary tangles,NFT）等。AD的发病机制目前尚未完全阐明,但自由基损伤学说和细胞凋亡学说备受人们的关注。自由基形成和氧化应激增强,进一步引起神经细胞凋亡,是导致AD的功能退化和神经变性的基础。p75神经营养因子受体（P75 neurotrophin receptor,P75NTR）是神经营养素的低亲和力受体,与AD神经元细胞凋亡有关。p75NTR诱导凋亡的信号通路目前仍不十分清楚,但已广泛公认的是其对c-jun氨基末端激酶（c-jun N-terminal kinase,JNK）的激活是介导神经元细胞凋亡的关键步骤,并进一步通过激活促凋亡蛋白P53、Bad等的表达,促进或引起细胞凋亡。此外,JNK还能通过诱导细胞色素C的释放进一步活化Caspase-3而导致细胞凋亡。研究并建立可靠的AD动物模型对于探明AD的病因、发病机制及防治药物的研发均有重要的意义。到目前为止用于AD研究的动物模型很多,其中给小鼠慢性注射D-半乳糖（D-galactose,D-gal）已成为一种常见的制备方法,广泛用于AD等神经退行性疾病的药理学研究。此外,转基因模型是一种病因模型,过量表达人源性突变AD相关基因的转基因鼠,因其具有明确的病因,并能反映AD的部分病理与功能变化,有助于我们了解AD的发病机制,也逐渐成为研究AD的整体模型。防治AD的抗氧化剂及抗凋亡药物的研究与开发成为当今药理学研究领域的重要课题之一。（-）表没食子儿茶素没食子酸酯（epigallocatechin-3-gallate,EGCG）是绿茶的一种主要多酚成分,研究证实绿茶有效的铁螯和、抗氧化、抗炎、抗癌及神经保护等作用的发挥主要依赖于EGCG。Levites等通过研究人类成神经细胞瘤SHSY5Y细胞和大鼠成纤维细胞瘤PC12细胞,发现EGCG能够减少具有神经毒性作用的Aβ的产生。因此,本研究拟通过D-半乳糖皮下注射建立的AD小鼠模型及遗传性的APP/PS1转基因小鼠,采用Niss1、TUNEL染色、免疫组化、Westernblot等方法研究D-半乳糖对小鼠认知行为、病理改变、抗氧化能力、细胞凋亡、Aβ（1-40）、淀粉样前体蛋白（Amyloid precursor Protein,APP）、促凋亡蛋白caspase-3及P75-JNK-P53凋亡相关通路的影响,以及9月龄的APP/PS1转基因小鼠上述指标的改变,同时进一步探讨EGCG对两种AD小鼠模型的神经保护作用及其作用机制。材料与方法D-半乳糖诱导的AD模型鼠实验:取昆明系小鼠96只,随机分成6组,每组16只,即空白对照组（Control）、模型组1（D-gal+ddH2O）、模型组2（D-gal+oil）、VE阳性对照组（D-gal+280IU/kg VE）、EGCG低剂量处理组（D-gal+2 mg/kgEGCG）、EGCG高剂量处理组（D-gal+6 mg/kg EGCG）。每日给两模型组及VE阳性对照组、EGCG低剂量及高剂量处理组小鼠按150 mg/kg皮下注射3%的D-半乳糖一次,空白对照组小鼠每天皮下注射等体积的生理盐水一次,连续注射6周。第三周开始给VE阳性对照组、EGCG低剂量及高剂量处理组小鼠每日分别按280IU/kg灌胃5.6%VE、按2 mg/kg灌胃0.04%的EGCG、按6 mg/kg灌胃0.12%的EGCG一次,空白对照组及模型组1小鼠灌胃等量的双蒸水一次,模型组2灌胃等量的大豆油一次,连续给药4周。最后一周对小鼠进行水迷宫、避暗及自主活动等行为学检测,其间继续给药。行为学结束后,快速取一部分小鼠海马入-80℃中冻存,分别进行SOD、GSH-Px酶活性、MDA含量的测定及Western blot印迹分析APP、caspase-3、P75、JNK2及P53等蛋白表达水平。另一部分小鼠进行脑灌流固定,分别进行HE染色、Niss1染色、TUNEL染色及Aβ（1-40）、caspase-3、APP等免疫组化的检测。APP/PS1转基因小鼠实验取C57小鼠10只及APP/PS1小鼠20只,随机分成3组:C57对照组（Control）、模型组（APP/PS1）、实验组（APP/PS1+2 mg/kgEGCG）。每日给实验组APP/PS1转基因小鼠按2 mg/kg灌胃0.04%的EGCG一次,给对照组及模型组小鼠灌胃等量的双蒸水一次,连续灌胃4周。最后两日对小鼠进行避暗实验的行为学检测,其间继续给药。行为学结束后,快速取一部分鼠海马入-80℃中冻存,进行Western blot印迹分析P75、JNK2及P53等蛋白表达水平。另一部分小鼠进行脑灌流固定,进行HE染色及Aβ（1-40）免疫组化的检测。实验结果1、EGCG对D-半乳糖诱导的AD小鼠记忆及判断能力的影响水迷宫、避暗、自主活动等行为学结果显示D-半乳糖（150 mg/kg）皮下注射6周后,小鼠出现明显的学习记忆及判断能力的下降,但活动能力未受影响;EGCG（2 mg/kg和6 mg/kg）和VE（280IU/kg）均明显的改善了D-半乳糖诱导的AD模型小鼠的学习记忆障碍。2、EGCG对D-半乳糖诱导的AD模型鼠脑组织病理改变的影响HE染色及Niss1染色结果显示,D-半乳糖（150mg/kg）皮下注射6周后,小鼠大脑皮层及海马区神经元数量明显减少,细胞排列松散,尼氏体分界不清,可见坏死的神经元;EGCG（2 mg/kg和6 mg/kg）和VE（280IU/kg）均明显的减轻了D-半乳糖引起的神经元损伤程度。3、EGCG对D-半乳糖诱导的AD模型鼠脑内Aβ（1-40）蛋白表达的影响Aβ（1-40）蛋白免疫组化染色结果显示:D-半乳糖（150 mg/kg）皮下注射6周后,小鼠大脑皮层及海马区的Aβ（1-40）蛋白表达水平显著增高;EGCG（2 mg/kg和6mg/kg）和VE（280IU/kg）均能明显抑制小鼠大脑皮层及海马区的Aβ（1-40）蛋白表达水平。4、EGCG对D-半乳糖诱导的AD小鼠海马区SOD、GSH-Px酶活性及MDA含量的影响酶学结果显示D-半乳糖（150 mg/kg）皮下注射6周后,小鼠海马内SOD、GSH-Px酶活性明显降低,MDA含量明显升高;EGCG（2 mg/kg和6 mg/kg）及VE（280IU/kg）均能明显的提高小鼠海马内SOD、GSH-Px酶活性,并明显的降低MDA含量。5、EGCG对D-半乳糖诱导的AD模型鼠脑区神经元细胞凋亡的影响TUNEL法染色结果显示D-半乳糖（1 50 mg/kg）诱导的AD模型鼠大脑皮层及海马区可见有较多的凋亡细胞,且细胞凋亡指数与空白对照组比明显增多;EGCG（2 mg/kg和6 mg/kg）及VE（280IU/kg）均能明显的减少D-半乳糖诱导的神经元细胞的凋亡。6、EGCG对D-半乳糖诱导的AD模型鼠脑内caspase-3蛋白表达的影响Caspase-3免疫组化染色及Western blot印迹分析结果显示D-半乳糖（150mg/kg）诱导了小鼠大脑皮层及海马区的caspase-3蛋白表达水平明显增高;EGCG（2 mg/kg和6 mg/kg）明显的抑制了D-半乳糖诱导的小鼠大脑皮层及海马区的caspase-3蛋白表达水平的增高;VE（280IU/kg）无明显的抑制作用。7、EGCG对D-半乳糖诱导的AD模型鼠脑内APP蛋白表达的影响APP免疫组化染色及Western blot印迹分析结果显示D-半乳糖（150 mg/kg）诱导了小鼠大脑皮层及海马区的APP蛋白表达水平明显增高;EGCG（2 mg/kg和6mg/kg）及VE（280IU/kg）均明显的抑制了D-半乳糖诱导的小鼠大脑皮层及海马区的APP蛋白表达水平的增高。8、EGCG对D-半乳糖诱导的AD模型鼠海马内P75NTR、JNK2及P53蛋白表达的影响Western blot印迹分析结果显示D-半乳糖（150 mg/kg）明显的促进了小鼠海马内P75蛋白的剪切,增加了核内转移的p75ICD的表达水平,同时也明显的诱导了小鼠海马区JNK2及P53蛋白表达水平增加;EGCG（2 mg/kg和6 mg/kg）可明显的抑制D-半乳糖诱导的p75ICD、JNK2及P53蛋白表达水平的增加;VE（280IU/kg）未见明显的抑制作用。9、EGCG对APP/PS1转基因小鼠记忆及判断能力的影响避暗实验结果显示APP/PS1转基因小鼠与C57小鼠比出现了明显的记忆障碍;EGCG（2 mg/kg）可明显的改善APP/PS1转基因小鼠的记忆障碍。10、EGCG对APP/PS1转基因小鼠脑内Aβ（1-40）蛋白表达的影响Aβ（1-40）蛋白免疫组化染色结果显示:APP/PS1转基因小鼠大脑皮层及海马区Aβ（1-40）蛋白表达水平与C57小鼠比明显增高;EGCG（2 mg/kg）可明显的降低APP/PS1转基因小鼠大脑皮层及海马区Aβ（1-40）蛋白表达水平。11、EGCG对APP/PS1转基因小鼠海马内P75NTR、JNK2及P53蛋白表达的影响Western blot印迹分析结果显示APP/PS1转基因小鼠海马内p75ICD、JNK2及P53蛋白表达水平与C57小鼠比明显增高;EGCG（2 mg/kg）可明显的抑制APP/PS1转基因小鼠海马区的p75ICD、JNK2及P53蛋白表达水平。结论1、EGCG能够改善D-半乳糖诱导的AD模型小鼠及APP/PS1转基因小鼠的学习记忆障碍。2、EGCG能够提高D-半乳糖诱导的AD模型小鼠海马内的抗氧化酶活性,发挥有效的抗氧化作用。3、EGCG通过抑制D-半乳糖诱导的AD模型小鼠大脑皮层及海马内的APP及Aβ（1-40）蛋白水平,对神经细胞发挥一定的保护作用。4、EGCG通过抑制D-半乳糖诱导的AD模型小鼠及APP/PS1转基因小鼠海马内p75ICD、JNK2及P53凋亡通路相关蛋白表达水平,进一步抑制caspase-3蛋白活性,对神经细胞发挥有效的抗凋亡作用。

论文目录

• 一、摘要
• 中文论著摘要
• 英文论著摘要
• 二、英文缩略语
• 三、论文
• 论文一 EGCG对D-半乳糖诱导的AD模型鼠抗氧化作用的研究
• 前言
• 材料与方法
• 实验结果
• 讨论
• 结论
• 论文二 EGCG对D-半乳糖诱导的AD模型鼠神经细胞凋亡保护机制的研究
• 前言
• 材料与方法
• 实验结果
• 讨论
• 结论
• 论文三 EGCG对APP/PS1转基因小鼠的保护作用及其可能机制的研究
• 前言
• 材料与方法
• 实验结果
• 讨论
• 结论
• 四、本研究创新性的自我评价
• 五、参考文献
• 六、附录
• 综述
• 在学期间科研成绩
• 致谢
• 个人简历