玉米丝氨酸消旋酶的重组表达、纯化及其酶学性质研究

论文摘要

丝氨酸消旋酶（serine racemase，SR）是一个双功能酶，同时具有消旋酶和脱水酶活性，可以将L-/D-丝氨酸转化成相应的D-/L-丝氨酸；还可以将L-/D-丝氨酸转化成丙酮酸。已研究了拟南芥、大麦和水稻SR的酶学性质，但是重组蛋白的C端都含有组氨酸标签。在数种植物中，玉米对外源D-丝氨酸的耐受性最高，但其分子机制尚不清楚，为此，本文研究了不同标签对重组玉米SR的各种活性的影响，分析了重组蛋白转化D-丝氨酸的活性，尝试利用玉米SR作为筛选标记转化烟草，获得如下结果：1.克隆并分析了玉米丝氨酸消旋酶编码基因。从NCBI中搜索到与大麦SR高度同源的玉米SR预测基因NM001143028.1，利用RT-PCR的方法，从玉米幼叶中克隆该编码基因。从核苷酸序列推定的氨基酸序列比对显示玉米基因编码与登陆的不同植物SR，包括大麦（BAF63026.1），水稻（NP001053521.1），高粱（AAT42169.1）和拟南芥（XP002872605.1）的相似性分别为87%，91%，94%和69%，表明它与禾本科单子叶植物SR的同源性高，与拟南芥同源性低。2.表达和纯化了玉米SR。不同表达载体中的诱导表达结果显示，SR编码基因插入pET28-TEV中，诱导表达His-SR后，TEV酶切除His-tag标签的效果最好。纯化的His-SR和SR亚基分子量分别为38kDa和36kDa。蛋白的表达量分别为2.5mg/ml和1.93mg/ml。3.带标签和不带标签玉米SR的活性分析。结果表明，无标签的SR活性最高。C端His-tag明显降低脱水酶活性，但对消旋酶活性抑制较小；N端His-tag对丝氨酸消旋酶活性和脱水酶活性比N端标签的抑制效果不明显。4.分析了SR的脱水酶酶学性质。反应的最适温度是37℃，最适pH为8.8，在Mn2+存在的条件下活性最大SR的Km值是12.5mM，Vmax值是8.4nmol/min/mg。5. SR作为筛选标记转化烟草。在含有10mM D-丝氨酸的选择培养基上进行筛选，初步获得了转基因烟草，PCR检测结果呈阳性，表明SR可以作为一种无抗性选择标记。综上所述，本研究克隆了编码玉米SR的基因，研究了不同标签下重组SR的多种活性，分析了SR的脱水酶性质，发现组氨酸标签对酶的活性有一定影响。另外，尝试利用SR作为筛选标记转化烟草，初步获得转基因植株。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 文献综述
• 1 引言
• 1.1 研究目的和意义
• 1.2 研究内容
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.2 方法
• 2.2.1 丝氨酸消旋酶基因引物的设计
• 2.2.2 玉米丝氨酸消旋酶编码基因（SR）的扩增
• 2.2.3 原核表达载体的构建
• 2.2.4 重组蛋白的诱导表达和纯化
• 2.2.5 玉米 SR-His、His-SR 酶活力测定
• 2.2.6 无标签 SR 的酶学性质分析
• 2.2.7 农杆菌转化烟草
• 2.2.8 转基因烟草的 PCR 检测
• 3 结果与分析
• 3.1 玉米丝氨酸消旋酶的表达、纯化
• 3.1.1 玉米幼叶总 RNA 的提取
• 3.1.2 SR 的引物设计与基因片段扩增
• 3.1.3 SR 编码基因序列测定
• 3.1.4 表达载体的构建
• 3.1.5 温度对蛋白诱导表达的影响
• 3.1.6 蛋白 SR-His 和 His-SR 的表达与纯化
• 3.1.7 蛋白 His-SR、SR 和 SR-His 的含量测定
• 3.1.8 蛋白 SR-His 的光谱扫描图
• 3.2 玉米丝氨酸消旋酶的酶学性质分析
• 3.2.1 SR-His 和 His-SR 的活性测定
• 3.2.2 温度对 SR 脱水酶活性的影响
• 3.2.3 pH 对 SR 脱水酶活性的影响
• 3.2.4 金属离子对 SR 脱水酶活性的影响
• 3.2.5 SR 脱水酶动力学参数的确定
• 3.3 SR 作为筛选标记的遗传转化
• 3.3.1 抗性植株的筛选
• 3.3.2 抗性植株的 PCR 鉴定
• 4 讨论
• 4.1 丝氨酸消旋酶的表达
• 4.2 丝氨酸消旋酶的产量
• 4.3 丝氨酸消旋酶的酶学性质研究
• 4.4 SR 作为无抗性选择标记
• 5 结论
• 参考文献
• 致谢
• 个人简介