中华绒螯蟹性腺抑制激素基因的克隆与表达

论文摘要

中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）是我国一种食用风味独特,营养保健价值极高的名优淡水养殖品种。然而,在其养殖的过程中,普遍发生1龄蟹性早熟的现象严重影响其产量,给生产带来巨大损失,严重制约着中华绒螯蟹养殖业的发展。研究表明,性腺抑制激素对性腺发育过程起重要调节作用。利用分子生物学手段研究性腺抑制激素,在部分虾类中已得到性腺抑制激素基因序列,然而尚未见蟹类方面的报道。本实验利用RACE方法获得了中华绒螯蟹性腺抑制激素基因cDNA的全序列,并对编码性腺抑制激素的基因片段进行表达。根据已知物种的性腺抑制激素基因序列,选取保守区设计引物。利用RNAiso? Plus试剂提取中华绒螯蟹视上神经节总RNA,RACE法扩增性腺抑制激素基因序列。凝胶回收所得片段后与pMD19-T载体连接并转化大肠杆菌DH5α,挑取阳性克隆送去测序,序列拼接得到了一条长1458 bp的cDNA序列。所得序列与五种已知性腺抑制激素序列相似性较高,且相似区域都在五种性腺抑制激素的编码框架之内。根据RACE实验得到的中华绒螯蟹性腺抑制激素基因片段设计表达引物,构建表达重组质粒pET-GIH,使用表达菌株Rosetta成功进行了蛋白表达,通过SDS-PAGE电泳分析表明该表达蛋白大小约为10 ku,与已报道的性腺抑制激素分子量相符,初步确认得到的序列为中华绒螯蟹性腺抑制激素序列。经QIAexpress纯化体系纯化后,利用考马斯亮蓝法测得纯化蛋白浓度为6.83μg/mL。体外培养和体内注射实验表明重组GIH蛋白对卵巢发育表现出抑制作用。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
• 1.1 甲壳动物眼柄激素研究进展
• 1.1.1 高血糖激素
• 1.1.2 蜕皮抑制激素
• 1.1.3 性腺抑制激素
• 1.1.4 大颚器抑制激素
• 1.1.5 中华绒螯蟹眼柄视上神经节结构研究
• 1.2 中华绒螯蟹性早熟机制的研究
• 1.2.1 中华绒螯蟹性早熟的内在因素
• 1.2.2 中华绒螯蟹性早熟的外在因素
• 1.3 cDNA 末端快速扩增
• 1.3.1 RACE 技术
• 1.3.2 RACE 技术的优点
• 1.4 研究目的和意义
• 第2章 中华绒螯蟹性腺抑制激素cDNA 序列的克隆
• 2.1 实验材料与方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 试剂与仪器
• 2.1.3 方法
• 2.2 结果
• 2.2.1 中华绒螯蟹眼柄视上神经节总RNA 的提取
• 2.2.2 性腺抑制激素全基因的克隆
• 2.2.3 序列拼接及分析
• 2.3 讨论
• 第3章 中华绒螯蟹性腺抑制激素部分肽段的原核表达
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 试剂与仪器
• 3.1.3 方法
• 3.2 结果
• 3.2.1 性腺抑制激素基因表达重组质粒的构建
• 3.2.2 性腺抑制激素序列的表达
• 3.2.3 pET-GIH 表达产物的可溶性分析
• 3.2.4 重组蛋白的纯化
• 3.2.5 重组蛋白的浓度测定
• 3.2.6 重组蛋白的鉴定
• 3.3 讨论
• 结语
• 参考文献
• 致谢