β-甘露聚糖酶基因测序、克隆表达及其工程菌的代谢通量研究

论文摘要

β-甘露聚糖酶是一种重要的半纤维素酶,可应用于食品、医药、饲料、采油等许多领域。本文以β-甘露聚糖酶的分子生物学研究为核心,利用基因工程和代谢工程的方法开展工作,主要结论如下:菌株鉴定:综合运用形态观察、生理生化实验及16S rDNA序列分析的方法鉴定了实验室保藏的产β-甘露聚糖酶菌株的属种,结果表明:该菌株为枯草芽孢杆菌,并命名为Bacillus subtilis TJ-200603。序列信息:利用简并PCR的方法确定了Bacillus subtilis TJ-200603β-甘露聚糖酶的保守序列,与Bacillus subtilis G1（DQ309335）具有高达98%的同源性,再经同源PCR最终确定了β-甘露聚糖酶的完整序列,在线工具预测表明:ORF包含1104bp,编码367个氨基酸,前31个氨基酸为信号肽,后面336个氨基酸为β-甘露聚糖酶成熟肽,蛋白分子量为38kDa,等电点为5.6。氨基酸序列分析表明:Bacillus subtilis TJ-200603甘露聚糖酶属于糖苷水解酶家族26。目前,β-甘露聚糖酶序列已在向GenBank库提交中。大肠杆菌中的克隆、表达:成功构建了重组克隆质粒pMD–man,实现了在E.coli DH5α中的克隆;成功构建了重组表达质粒pET-22b-man,实现了在E.coli BL21 （DE3）中的诱导表达。SDS-PAGE表明:表达的重组蛋白分子量约为38.005kDa,与预测值基本一致。蛋白主要集中在周质空间和胞内,含量分别为36.03μg/mL和97.02μg/mL,酶活分别为4.8U/mL和6.7U/mL。代谢通量分析:建立了大肠杆菌基因工程菌的代谢网络,利用代谢通量分析的方法,对大肠杆菌工程菌产甘露聚糖酶的代谢途径进行了分析,并对其中5个重要节点做了详细讨论。热稳定性研究:基于已获知的β-甘露聚糖酶一级序列及同源模建得到的酶蛋白高级结构,并利用羟基可与酶活性位点形成氢键而稳定高级结构的结论,筛选酶蛋白的多羟基保护剂。山梨醇（2g/L）、蔗糖（2g/L）、壳聚糖（2g/L）使β-甘露聚糖酶的相对酶活分别达到222.8%、201.3%、198.7%;山梨醇（2g/L）、壳聚糖（1g/L）、蔗糖（3g/L）的复合保护剂使β-甘露聚糖酶的相对酶活达到最高,为258.1%;β-甘露聚糖酶的最适反应温度从原来的50℃提高到60℃,65℃下失活速率常数kinac减小、半衰期t1/2延长,均表明了保护剂对β-甘露聚糖酶的稳定作用。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第一章 文献综述
• 1.1 β-甘露聚糖酶产生菌
• 1.1.1 β-甘露聚糖酶的来源
• 1.1.2 β-甘露聚糖酶产生菌的筛选
• 1.1.3 β-甘露聚糖酶产生菌的鉴定
• 1.2 β-甘露聚糖酶的分子生物学研究
• 1.2.1 β-甘露聚糖酶的克隆与序列特点
• 1.2.2 β-甘露聚糖酶的表达
• 1.2.3 表达载体
• 1.2.4 大肠杆菌表达系统
• 1.3 代谢网络及代谢通量分析
• 1.4 β-甘露聚糖酶的结构与稳定性
• 1.5 β-甘露聚糖酶的应用
• 1.5.1 在饲料添加剂中的应用
• 1.5.2 在纸浆工业中的应用
• 1.5.3 在食品中的应用
• 1.5.4 在石油破胶剂中的应用
• 1.5.5 在其他方面的应用
• 1.6 本文主要研究内容
• 第二章 β-甘露聚糖酶生产菌株的鉴定
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌种与质粒
• 2.1.2 试剂盒、工具酶和生化试剂
• 2.1.3 培养基
• 2.1.4 主要溶液
• 2.1.5 实验室仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 刚果红染色法对菌株的筛选鉴定
• 2.2.2 β-甘露聚糖酶产生菌株的常规鉴定
• 2.2.3 16S rDNA 系统发育分析
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 刚果红染色快速鉴定
• 2.3.2 形态与生理生化鉴定
• 2.3.3 16S rDNA 系统发育分析
• 2.4 小结
• 第三章 Bacillus subtilis TJ-200603β-甘露聚糖酶的测序、克隆与表达
• 3.1 材料
• 3.1.1 菌种与质粒
• 3.1.2 试剂盒、工具酶和生化试剂
• 3.1.3 主要溶液
• 3.1.4 实验室仪器
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 β-甘露聚糖酶基因部分序列的分析
• 3.2.2 β-甘露聚糖酶基因全长序列的分析
• 3.2.3 β-甘露聚糖酶成熟肽的基因克隆
• 3.2.4 原核表达载体 pET-22b-man 的构建与转化
• 3.2.5 重组蛋白的诱导表达
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 β-甘露聚糖酶基因部分序列的分析
• 3.3.2 β-甘露聚糖酶基因全长序列的分析
• 3.3.3 β-甘露聚糖酶成熟肽的基因克隆
• 3.3.4 原核表达载体 pET-22b-man 的构建与转化
• 3.3.5 重组蛋白的诱导表达
• 3.4 小结
• 第四章 产β-甘露聚糖酶大肠杆菌工程菌的代谢通量分析
• 4.1 代谢通量分析原理
• 4.2 E.coli 的生化反应网络
• 4.3 E.coli 代谢模型的建立
• 4.4 E.coli 代谢模型的优化计算
• 4.5 结果与讨论
• 4.5.1 以β-甘露聚糖酶的生物合成为优化目标的代谢流分析
• 4.5.2 以菌体的生长为优化目标的代谢流分析
• 4.5.3 代谢网络中重要节点的比较分析
• 4.6 小结
• 第五章 β-甘露聚糖酶热稳定性的研究
• 5.1 材料
• 5.1.1 试剂
• 5.1.2 实验室仪器
• 5.2 实验方法
• 5.2.1 酶活力的测定方法
• 5.2.2 酶液与保护剂贮液的配制
• 5.2.3 酶热稳定性的测定
• 5.2.4 复合保护剂配比的正交设计
• 5.2.5 保护剂存在时β-甘露聚糖酶最适反应温度的测定
• 5.2.6 β-甘露聚糖酶热失活曲线的测定与失活参数的计算
• 5.3 结果与讨论
• 5.3.1 单一保护剂对β-甘露聚糖酶稳定性的影响
• 5.3.2 不同配比的复合保护剂对β-甘露聚糖酶稳定性的影响
• 5.3.3 保护剂存在时β-甘露聚糖酶最适反应温度
• 5.3.4 65℃下β-甘露聚糖酶失活动力学和热力学及保护机理分析
• 5.4 小结
• 第六章 结论与展望
• 6.1 结论
• 6.2 展望
• 参考文献
• 发表论文和参加科研情况
• 附录
• 致谢