壳聚糖纳米粒介导猪Ghrelin基因对小鼠生长的影响

论文摘要

Ghrelin是含有为保持活性所必需辛酰基化部位的28个氨基酸多肽,最早在人和鼠的胃内被发现并被认为是一种生长激素释放激素受体（growth hormonesecretagogue receptor,GHSR）的天然配体。研究发现,Ghrelin与其受体结合后除了能促进生长激素（growth hormone,GH）的释放外,还能调节胃肠运动、能量代谢平衡,并在人类多种疾病或病理状态和动物的促生长中发挥重要的作用。因此,Ghrelin的研究是目前人们所关注的一个热点。本研究采用RT-PCR从猪胃底腺克隆Ghrelin基因,在Ghrelin基因两端分别引入NheⅠ和XhoⅠ酶切位点构建pcDNA3.1（+）-Ghrelin真核表达载体。以壳聚糖为载体,采用复凝聚法制备了CS-pcDNA3.1（+）-Ghrelin纳米粒。CS-pcDNA3.1（+）-Ghrelin纳米粒的检测结果表明:纳米粒平均粒径为180.4±13.5nm,包封率为95±1.27%,载基因纳米粒中DNA的含量为37±2.0%。将CS-pcDNA3.1（+）-Ghrelin纳米粒注射断乳小鼠后肢肌肉（剂量为0.5mg质粒/kg BW）,研究其对小鼠生长的影响。结果表明,0～5d注射裸质粒组小鼠累积增重最显著（载质粒纳米粒组4.41±0.23g、裸质粒组5.42±0.61g、生理盐水组3.93±0.96g）;0～25d载质粒纳米粒组的累积增重分别比裸质粒组、生理盐水组高12.0%、25.4%（P＜0.05）;检测30d小鼠血液GH浓度,结果表明,载质粒纳米粒组GH浓度（2.36±0.32ng/mL）均明显高于生理盐水组（1.75±0.23ng/mL）和裸质粒组（1.78±0.26ng/mL）,而裸质粒纳米粒组GH浓度与生理盐水组相比略高。本研究表明,Ghrelin基因对小鼠有很好的促生长作用,而壳聚糖介导的CS-pcDNA3.1（+）-Ghrelin纳米粒能够更加有效、持久的促进小鼠生长,这种作用主要是通过提高血清GH浓度实现的。本研究为Ghrelin纳米缓释质粒的临床应用奠定了理论和试验基础。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 英文缩写词汇表（Abbreviation）
• 第一章 文献综述
• 1 Ghrelin基因的研究进展
• 1.1 Ghrelin的化学结构与分布定位
• 1.2 Ghrelin受体的化学结构与分布定位
• 1.2.1 Ghrelin的结构及功能
• 1.2.2 Ghrelin的合成与分布
• 1.3 Ghrelin的受体分布
• 1.4 Ghrelin的作用机制
• 1.5 Ghrelin的生理功能
• 1.5.1 促进GH的分泌、调节生长
• 1.5.2 增强食欲、调节能量代谢
• 1.5.3 对胃肠功能与胃肠道发育的影响
• 1.5.4 对心血管功能和活动能力的影响
• 1.5.5 增强机体免疫力与抗应激能力
• 1.6 Ghrelin的研究与其在畜牧业中的应用前景
• 2 壳聚糖纳米基因载体系统的研究进展
• 2.1 壳聚糖的发现
• 2.2 壳聚糖的分子结构与理化特性
• 2.3 壳聚糖的生物学特性
• 2.4 壳聚糖纳米控释系统在医药学方面的应用
• 2.4.1 DNA载体
• 2.4.2 蛋白类药物载体
• 2.5 壳聚糖载基因缓释系统的应用
• 2.6 壳聚糖衍生物的研究与应用
• 2.7 壳聚糖在其他领域的应用
• 2.8 壳聚糖研究的前景与意义
• 第二章 研究内容
• 试验一 猪Ghrelin基因真核表达载体的构建
• 1 试验材料和方法
• 1.1 试验材料
• 1.1.1 样品来源
• 1.1.2 菌株及质粒
• 1.1.3 试验试剂
• 1.1.4 引物
• 1.1.5 主要仪器设备
• 1.2 试验方法
• 1.2.1 猪胃底腺组织总RNA的提取
• 1.2.2 RT-PCR扩增猪Ghrelin基因片段
• 1.2.3 PCR产物的回收
• 1.2.4 猪Ghrelin基因的克隆与序列分析
• 1.2.5 pcDNA3.1（+）-Ghrelin重组质粒的构建
• 1.2.6 转染质粒的大量提取与纯化及DNA浓度的测定
• 2 结果
• 2.1 总RNA的提取与检验
• 2.2 RT-PCR扩增Ghrelin基因
• 2.3 PCR产物的基因克隆及酶切的结果
• 2.4 pcDNA3.1（+）-Ghrelin重组质粒的酶切鉴定
• 2.5 pcDNA3.1（+）-Ghrelin重组质粒的测序验证结果
• 3 讨论
• 3.1 克隆技术的选择
• 3.2 真核表达载体的选择
• 4 小结
• 试验二 壳聚糖Ghrelin基因纳米粒的制备及其对小鼠生长的影响
• 1 试验材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.1.1 试验动物
• 1.1.2 试验试剂
• 1.1.3 主要仪器设备
• 1.2 试验方法
• 1.2.1 质粒含量的测定
• 1.2.2 N/P比的确定
• 1.2.3 CS-pcDNA3.1（+）-Ghrelin纳米粒和空纳米粒的制备
• 1.2.4 CS-pcDNA3.1（+）-Ghrelin纳米粒的粒径与形态测定
• 1.2.5 CS-pcDNA3.1（+）-Ghrelin纳米粒包封率和载药量的检测
• 1.2.6 CS-pcDNA3.1（+）-Ghrelin纳米粒对Ghrelin基因的保护作用
• 1.2.7 壳聚糖纳米粒包裹质粒DNA的动物试验
• 1.2.8 称重、血样的采集及GH含量的测定
• 2 结果
• 2.1 质粒DNA的鉴定
• 2.2 CS-pcDNA3.1（+）-Ghrelin纳米粒的粒径与形态测定
• 2.3 CS-pcDNA3.1（+）-Ghrelin纳米粒包封率和载药量的检测
• 2.4 CS-pcDNA3.1（+）-Ghrelin纳米粒对Ghrelin基因的保护作用结果
• 2.5 各组小鼠在注射后各时间段的平均累积增重
• 2.6 小鼠血清GH浓度的检测
• 3 讨论
• 3.1 纳米粒介导基因转移技术
• 3.2 CS-pcDNA3.1（+）-Ghrelin纳米粒对小鼠生长的影响
• 4 小结
• 参考文献
• 致谢
• 附录