莱菔硫烷对内毒素性急性肝损伤保护作用的实验研究

论文摘要

背景内毒素,即脂多糖（LPS） ,是所有革兰阴性杆菌的细胞外膜成分,是引起脓毒血症及全身炎症反应综合征的主要因素,严重创伤、感染、肝病以及众多危重疾病在其发生发展过程中多可以发生内毒素血症（endotoxemia）。内毒素血症也可导致多器官功能衰竭,肝脏是最容易受损的器官之一,两者之间存在互为因果、相互影响的关系,一旦发生容易形成恶性循环。因此,阻断该循环中的某些链条,阻止内毒素对肝脏的进一步损害,是亟待解决的关键问题,但迄今为止,临床尚缺乏特殊、有效的手段治疗内毒素引起的肝损伤。目前临床治疗内毒素急性肝损伤通常用药物治疗,常用药物如下:①地塞米松:可能与其抑制一氧化氮（NO）过量产生,抑制脂质过氧化反应,增加组织抗氧化活性有关;②血小板活化因子受体拮抗剂:可能与抗膜磷脂的降解作用及抑制氧自由基的产生;③甘氨酸:抑制枯否细胞的分泌功能,使肿瘤坏死因子-а（TNF-а）分泌减少,抑制肠道肥大细胞脱颗粒,组胺释放减少,肠道壁通透性降低,从而使肠源性内毒素入血减少,血浆内毒素水平下降;④LPS拮抗剂:可以降低LPS的生物活性,加快其通过红细胞和中性粒细胞的CRI受体的清除率;也有实验证明,抗LPS单抗对动物的保护作用并不直接通过降低TNF-а,而是降低血管内皮细胞对TNF-а的敏感性,以及减少其他细胞因子活性,如IL-6等。⑤中药:如解毒护肝冲剂、茵陈汤,机制尚不十分明确。目前的治疗方面存在着明显的缺点,如地塞米松:副作用大,特别是可致免疫功能下降,使机体清除感染的能力降低,易致感染扩散,有进一步加重内毒素血症可能;LPS拮抗剂:价格昂贵,不能阻断肝病的进一步发展;目前治疗措施机制比较单一,大多忽略胆红素升高造成继发肝损伤,而且未涉及自身免疫调控,综合治疗力度明显不足。特别是采取多种药物联合使用,势必会增加肝脏负荷,增加病人经济负担。莱菔硫烷（SFN）是十字花科植物中含有的一种异硫氰酸盐,自1992年被发现具有化学保护作用以来,逐渐正成为国内外研究的热点。研究表明,SFN具有抑制I相酶、诱导II相酶,具有抗氧化损伤的作用;能诱导肿瘤细胞分裂周期停滞和凋亡,能抑制肿瘤血管上皮细胞,具有抗肿瘤作用;能SFN能提高自然杀伤细胞活性,增强吞噬细胞吞噬力,降低了由内毒素刺激的巨噬细胞产生的TNF-а水平,具有免疫调节的作用;能制幽门螺旋杆菌生长,具有一定的抗菌作用。由于其药物的毒副作用小,其药理机制可以对抗内毒素对肝脏损伤作用机制。目前国内外尚无相关研究,本实验的研究旨在明确SFN对内毒素急性肝损伤是否具有保护作用,为临床应用提高理论依据和实验经验。〔目的〕:建立内毒素急性肝损伤大鼠动物模型,明确清内毒素造成急性肝脏损伤的病理生理特点,进一步阐明内毒素致急性肝损伤的作用规律及机制,利用SFN干预内毒素急性肝损伤大鼠,通过各项指标的检测明确SFN对内毒素急性肝损伤是否具有保护作用和作用强度,为临床治疗提供理论依据及实验经验。〔方法〕:（1）构建亚致死量LPS致D-半乳糖胺（D-GaLN）致敏肝细胞损伤大鼠动物模型。选择48只健康Wistar大鼠,随机分为三组,每组16只,每组再随机分为对照组和处理组。处理组分别腹腔注射亚致死量的内毒素LPS（50ug/Kg）+D-GaLN（300mg/Kg）,对照组仅注射1ml无菌生理盐,分别于6h、24h、48h经主动脉取大鼠全血,离心获取血清,后分别处死取大鼠,光镜下观察大鼠肝脏病理,全自动生化分析仪检测血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）、门冬氨酸氨基转移酶（AST）水平、总胆红素（BIL）水平,TUNEL染色肝组织凋亡细胞计数;ELISA检测血清白介素-1β（IL--1β）水平,RT-PCR检测肿瘤坏死因子-а（TNF-а）和尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶（UGT1A1） mRNA表达。（2） SFN对内毒素急性肝损伤的保护作用实验研究。将24只健康Wistar大鼠随机分为三组,即对照组、DEX干预组、SFN干预组,每组8只,每组事先分别腹腔注射LPS（50ug/Kg）+D-GaLN（300mg/Kg）,DEX干预组分别腹腔注入用Dex（5mg/Kg） 1ml,SFN干预组分别腹腔注入SFN 1mg/Kg 1ml,对照组仅注射1ml生理盐水,在24h处死大鼠后再次光镜下分析肝组织病理、用全自动生化分析仪检测血清ALT、AST、BIL水平,TUNEL染色肝组织凋亡细胞计数,ELISA检测血清IL--1β水平,RT-PCR检测TNF-аmRNA、UGT1A1 mRNA的表达。〔结果〕:建动物模型实验中:1.组织病理学特征:（1）对照组:肝小叶组织结构完整,未见肿胀、变性、坏死。（2） 6h处理组:肝细胞轻度浊肿,未见坏死。（3） 24h处理组:肝细胞广泛浊肿,点灶状坏死,中央静脉扩张充血.（4） 48h处理组:肝细胞广泛浊肿,大量点灶状坏死,大量炎症细胞侵润。2.血清ALT、AST、BIL水平:注射LPS/D-GaLN 6 h后开始升高,处理组较对照组明显升高,两者有显著差异（P<0.01）,后随时相改变,ALT、AST、TBIL水平逐渐上升,24h后达到高峰（ALT 3204.875+791.400,AST 3662.500+725.661,TBIL 65.100 +23.150）,24h组与6h组比较有显著差异（P<0.05）。后维持高水平,24h组与48h组比较无显著差异（P>0.05）。3.肝脏组织细胞凋亡检测:TUNEL染色表现为细胞核染成棕褐色,核固缩,染色质边集,胞质嗜酸性,肝脏组织细胞AI在6h升高,与对照组有显著性差异（P<0.01）,后随时相改变,凋亡细胞增加明显,24h达高峰（29.225+4.315）,24h组与6h组有显著显著性差异（P<0.01）,48h AI仍维持高水平。4. IL--1β、TNF-аmRNA、UGT1A1 mRNA表达检测结果:IL--1β在6h明显升高,与对照组有显著性差异（P<0.01）,24h开始下降,48h明显降低,与24组有显著性差异（P<0.01）,仍高于对照组（P<0.01）。TNF-аmRNA在6h明显升高,与对照组有显著性差异（P<0.01）,24h仍维持较高水平,48h明显降低,与对照组无显著性差异（P>0.05）。UGT1A1 mRNA在6h明显升高,与对照组有显著差异（P<0.01）,24h维持较高水平,48h开始下降,与24h组有显著差异（P<0.01）,与对照组无显著性差异（P>0.05）。在SFN对内毒素急性肝脏损伤保护作用的研究实验中:5.组织病理学特征:（1）对照组:肝脏可小叶结构完整,可见点状坏死,可见大量炎症细胞侵润。（2） DEX干预组:肝脏血管旁粘液样变,可见双核肝细胞,同时可见点灶状坏死。（3） SFN干预组:肝细胞广泛浊肿,未见明显坏死,可见肝细胞增生。6.血清ALT、AST、TBIL水平:SFN干预组与DEX干预组均能使其下降,与对照组比较有显著性差异（P<0.01）,两者比较无显著性差异（P>0.05）。7.肝脏组织细胞凋亡检测:SFN干预组与DEX干预组均能使AI下降,与对照组比较（P<0.01）,两者比较无显著性差异（P>0.05）。8. IL--1β、TNF-а、UGT1A1 RNA检测结果:只有SFN干预组在24h能降低IL--1β的生成,DEX干预组不能降低,与对照组比较无显著性差异（P>0.05）;SFN干预组与DEX干预组均能降低TNF-аmRNA的表达,与对照组比较（P<0.01）,SFN干预组降低作用更明显,与DEX干预组比较（P<0.01）;SFN干预组与DEX干预组均增强UGT1A1mRNA的表达,与对照组比较（P<0.01）,两者间增强效果无显著性差异（P>0.05）。〔结论〕:1.亚致死量LPS可造成D-GaLN致敏大鼠急性肝损伤,该模型适合于对内毒素急性肝损伤的进一步研究。2.细胞凋亡是内毒素急性肝损伤重要的形态学改变,应引起重视。3. IL--1β、TNF-а在早期（6h）出现了明显升高,因此早期干预可减少炎症介质对肝脏的第二次打击。4.内毒素肝损伤大鼠在胆红素代谢方面早期（6h、24h）代谢能力增强,晚期（48 h）下降,保护肝细胞,对降低高胆红素非常重要。5. SFN与DEX均能降低内毒素急性肝损伤大鼠的ALT、AST水平,减少细胞凋亡,降低TNF-аmRNA的表达,增强UGT1A1mRNA的表达,既减少了TNF-аmRNA对肝脏的二次打击,又能降低黄疸水平,说明SFN与DEX对内毒素急性肝损伤均有保护作用。6. SFN能降低IL--1β水平,降低TBIL水平,在降低TNF-аmRNA表达方面比DEX作用更强,说明SFN比DEX对内毒素急性肝损伤有更好的保护作用,具有良好的应用价值。

论文目录

• 英文缩写一览表
• Abstract
• 摘要
• 论文正文 莱菔硫烷对内毒素急性肝细胞损伤保护作用的实验研究
• 前言
• 第一部分 内毒素性急性肝损伤动物模型的构建
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 第二部分 莱菔硫烷对内毒素急性肝损伤保护作用实验研究
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 全文总结
• 致谢
• 图片
• 参考文献
• 文献综述 一莱菔硫烷的药理研究进展
• 参考文献
• 在读期间发表论文目录