HDAC抑制剂诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化及机制的研究

论文摘要

在软骨组织工程中，由于成熟的软骨细胞的自我修复和自我更新能力有限，难以满足组织构建需要，因此如何获得足够数量的软骨细胞是亟待解决的问题之一。骨髓间充质干细胞（MSCs）具有良好的向成骨和软骨等间质组织分化的能力。它不仅能够向多种细胞分化，而且在组织内含量丰富，在体外增殖并维持非分化状态以及易于分离、培养、扩增等特点都使其成为软骨组织工程有效的细胞来源。丙戊酸（VPA）作为一种典型的组蛋白酶抑制剂，已显示其在MSCs向肝细胞、神经细胞、成骨细胞等方面分化的诱导能力，但向软骨细胞方向分化的诱导还未见报道。本文通过简化诱导体系，成功利用1mM VPA将单层培养的第一代MSCs诱导成软骨样细胞。在细胞水平、蛋白水平以及基因水平上的检测结果表明，MSCs经合适浓度合适时间的VPA诱导后，快速分化成比较均一的、具椭圆形和多角形细胞形态的、能分泌特有细胞基质Ⅱ型胶原和蛋白多糖的软骨样细胞，显示了VPA在诱导软骨细胞分化方面良好的诱导潜力。本研究还比较了VPA和碱性成纤维生长因子（FGF-2）在诱导MSCs向软骨细胞分化方面的效果和效率的差异。通过细胞形态、分泌蛋白染色检测以及基因表达分析，发现HDAC抑制剂VPA和FGF-2在对软骨细胞的诱导效果类似，而两者联合诱导则明显降低诱导效率，还促使部分细胞凋亡。结果表明VPA可能在软骨分化过程中起到类似于生长因子FGF-2的作用，也有可能是通过抑制组蛋白去乙酰化酶活性改变染色体结构暴露FGF-2等转录因子结合位点开启相关基因的转录表达，从而促进软骨细胞的分化。对于细胞周期的检测发现诱导6天的软骨样细胞74％被阻滞在G0-G1期，基因表达显示Ⅱ型胶原mRNA含量达到高水平，说明细胞停止增殖，而处于活跃的分化状态。本研究揭示了VPA作为单一诱导剂在体外诱导MSCs向软骨细胞分化的巨大潜力，不仅为软骨细胞的诱导培养研究提供了新思路，还建立了一个简便经济的单层培养诱导体系，为组织工程软骨细胞的再生提供有效的，可靠的、丰富的自体细胞来源途径。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 目录
• 第一部分 综述
• 一.骨髓间充质干细胞的多向分化潜能
• （一） 骨髓间充质干细胞的跨胚层分化潜能
• （二） 骨髓间充质干细胞向骨细胞分化的潜能
• 1.向软骨细胞分化
• 2.向成骨细胞分化
• 3.向破骨细胞分化
• 二.软骨细胞的生长发育过程
• （一） 软骨的结构及成分
• （二） 软骨细胞的分化发育过程
• （三） 软骨细胞分化发育的调控
• 1.细胞因子在软骨分化发育中的调控作用
• 1.1 骨形态发生蛋白（BMP）
• 1.2 转移生长因子-β（TGF-β）
• 1.3 成纤维生长因子（FGF）
• 1.4 其他生长因子
• 2.转录因子对软骨生成的调节
• 2.1 Sox家族对软骨生成的调节
• 2.2 T-盒子（T-box）转录因子Brachyury对软骨生成的调节
• 2.3 Runx-2对软骨细胞分化的调控
• 3.化学物质对软骨分化发育的作用
• 4.物理因素对软骨分化发育的影响
• 4.1 三维支架
• 4.2 机械用力
• 三.软骨工程的研究现状及医疗前景
• 1.胚胎干细胞
• 2.骨髓间充质干细胞
• 3.脂肪干细胞
• 第二部分 实验研究
• 第一章 HDAC抑制剂诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的研究
• 一.引言
• 二.材料和方法
• 1.材料和试剂
• （1） 实验动物
• （2） 培养试剂
• （3） 检测试剂
• （4） 实验仪器
• （5） 引物序列
• 2.实验方法
• 2.1 骨髓间充质干细胞细胞的分离及培养
• 2.2 细胞活性测定
• 2.3 软骨细胞分化诱导方法
• 2.4 分化细胞的鉴定
• 2.4.1 形态学鉴定
• 2.4.2 结构染色鉴定
• 2.4.2.1 HE染色
• 2.4.2.2 甲苯胺蓝染色
• 2.4.3 免疫细胞化学
• 2.4.4 基因检测
• 2.4.4.1 细胞总RNA抽提
• 2.4.4.2 RNA含量测定
• 2.4.4.3 RNA电泳
• 2.4.4.4 RT-PCR反应
• 2.4.4.5 PCR反应
• 2.4.4.6 结果观察
• 三.实验结果
• 1.不同VPA浓度对骨髓间充质干细胞活性和分化的影响
• 2.VPA诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化
• 2.1 光镜细胞形态观察
• 2.2 软骨样细胞核质及蛋白多糖的染色
• 2.2.1 HE染色
• 2.2.2 甲苯胺蓝染色
• 2.3 软骨样细胞基因表达分析
• 2.4 软骨样细胞Ⅱ型胶原蛋白的表达
• 四.讨论
• 第二章 HDAC抑制剂诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化机制的初步研究
• 一.前言
• 二.实验材料及方法
• 1.实验材料
• 2.实验方法
• 2.1 诱导方法
• 2.2 细胞形态观察
• 2.3 甲苯胺蓝染色
• 2.4 基因表达分析
• 2.5 细胞周期分析
• 三.实验结果
• 1.不同诱导剂对MSCs向软骨细胞分化的诱导效果
• 1.1 细胞形态观察
• 1.2 甲苯胺蓝染色
• 1.3 基因表达分析
• 2.VPA对细胞周期的影响
• 四.讨论
• 致谢
• 参考文献