华南湍蛙皮肤新型多功能抗菌肽的纯化、鉴定、cDNA克隆与功能分析

论文摘要

湍蛙属隶属于两栖纲无尾目蛙科，作为蛙科各属中较为庞大的一个类群，全世界分布有45个种。目前关于湍蛙属两栖类皮肤分泌物中抗菌肽的报道较少，对于湍蛙属两栖类抗菌肽结构和功能方面的研究仍很匮乏。本研究利用蛋白质纯化技术结合蛋白质组学技术，首次成功从分布于中国西南部山区的华南湍蛙皮肤提取物中纯化并鉴定出3种新型抗菌肽，确定了他们的分子结构和功能活性。同时成功从华南湍蛙cDNA文库中克隆到5条抗菌肽cDNA序列，能够推导出5条不同的抗菌肽前体，并能够释放5种不同的成熟抗菌肽。这些成熟肽中的其中3条与纯化出抗菌肽结构相同。经分析这5条抗菌肽隶属于2个多肽家族，它们分别是brevinin-1和brevinin-2。因此，它们被命名为brevinin-1RTa （FLPLLAGVVANFLPQIICKIARKC）、brevinin-1RTb（FLGSLLGLVGKVVPTLFCKISKKC）、brevinin-1RTc （FLGSLLGLVGKIVPTLICKISKKC）、 brevinin-2RTa （GLMSTLKDFGKTAAKEIAQSLLSTASCKLAKTC）和brevinin-2RT（GILDTLKEFGKTAAKGIAQSLLSTASCKLAKTC）。其中brevinin-1RTa、brevinin-1RTb和brevinin-2RTb经RP-HPLC从华南湍蛙皮肤提取物中纯化得到，并且利用LC-MS/MS蛋白质组学方法从华南湍蛙皮肤分泌物中除鉴定到了纯化出的这3条多肽外，同时也鉴定出brevinin-2RTa的存在。同时我们通过人工化学合成法合成了这5种多肽来进一步研究其功能活性，经过抗菌活力测试发现本研究中鉴定出的所有多肽对所试的多种微生物显示不同的抗菌活力。此外，brevinin-2RTa和brevinin-2RTb对家兔红血球细胞的溶血活性相对较低，这一发现可能被用于开发新型抗菌药剂。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 文献综述
• 1 抗菌肽的研究进展
• 1.1 抗菌肽的定义
• 1.2 抗菌肽的分类
• 1.2.1 依据抗菌肽来源分类
• 1.2.2 从结构上对抗菌肽进行分类
• 1.3 抗菌肽生物学功能及抗菌作用机制
• 1.3.1 抗菌肽的生物学功能
• 1.3.2 抗菌肽的抗菌作用机制
• 1.4 抗菌肽的应用
• 2 抗菌肽的研究意义及前景
• 3 两栖类动物抗菌肽研究现状
• 3.1 皮肤特点
• 3.2 结构特点
• 3.3 功能活性
• 3.3.1 抗菌活性
• 3.3.2 抗肿瘤细胞活性
• 3.3.3 抗原虫活性
• 3.3.4 其他活性
• 4 两栖类皮肤抗菌肽的应用及前景
• 4.1 两栖类皮肤抗菌肽的应用
• 4.1.1 食品加工的应用
• 4.1.2 应用于医药临床
• 4.1.3 应用于动、植物基因工程技术
• 4.2 两栖类皮肤抗菌肽的应用前景
• 材料与方法
• 1 华南湍蛙皮肤分泌液中抗菌肽的分离纯化
• 1.1 实验动物
• 1.2 实验用菌种
• 1.3 实验试剂和仪器
• 1.4 华南湍蛙皮肤分泌物的收集
• 1.5 抗菌肽的分离纯化
• 1.6 抗菌活性检测
• 1.7 氨基酸序列分析和分子量测定
• 1.8 LC-MS/MS 鉴定样品制备
• 1.9 LC-MS/MS 分析
• 1.10 蛋白鉴定和数据库搜索
• 2 华南湍蛙皮肤组织 cDNA 的分子克隆
• 2.1 实验试剂
• 2.2 主要仪器及器材
• 2.3 总 RNA 的提取和 mRNA 的纯化
• 2.3.1 准备工作
• 2.3.2 TRIZOL 法提取总 RNA
• 2.3.3 利用 mRNA 纯化试剂盒纯化 mRNA（参照试剂盒说明书）
• 2.3.4 琼脂糖凝胶电泳
• 2.4 cDNA 序列的分子克隆
• 2.4.1 第一链 cDNA 的合成
• 2.4.2 第二链 cDNA 的合成
• 2.4.3 琼脂糖凝胶电泳
• 2.4.4 编码抗菌肽 cDNA 基因的克隆
• 2.4.5 PCR 产物纯化（按试剂盒说明书进行）
• 2.4.6 质粒 DNA 连接
• 2.4.7 热激转化大肠杆菌
• 2.4.8 阳性克隆的筛选
• 2.4.9 DNA 序列测定
• 3 华南湍蛙皮肤抗菌肽结构与功能分析
• 3.1 多肽的人工合成
• 3.2 抗菌活性的测定
• 3.2.1 实验用菌种
• 3.2.2 最小抑菌浓度（MIC）的测定
• 3.3 溶血活性检测
• 3.3.1 阿氏液（Alsever Solution）的配制
• 3.3.2 兔红细胞的制备
• 3.3.3 溶血试验
• 3.4 编码抗菌肽的 cDNA 的检测
• 3.5 抗菌肽的物理化学特性分析
• 3.6 多肽的人工合成
• 3.7 扫描电镜观察
• 3.7.1 抗菌肽处理菌株
• 3.7.2 扫描电镜样品处理
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间科研成果