猪传染性胃肠炎病毒的分子诊断与免疫研究

论文摘要

猪传染性胃肠炎（Transmissible gastroenteritis of pigs,TGE）是由猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）引起的猪的一种以呕吐、水样腹泻为主要特征的接触性传染病,进行TGEV的分子诊断及免疫研究,生产出对猪安全、有效并能迅速产生免疫力的基因工程疫苗为当前研究的主要任务。本研究从猪腹泻病料中分离出了TGEV,进行了血清学鉴定、电镜鉴定和RT-PCR鉴定。并扩增TGEV TS株核衣壳蛋白N基因和猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）QH株膜糖蛋白M基因,建立TGEV和PEDV的双重RT-PCR鉴别诊断方法。另外,克隆了TGEV纤突糖蛋白S基因,将其插入pAdTrack-CMV穿梭质粒中,获得了转移质粒pAdTrack-CMV/S,对之线性化后,用pAdEasyTM系统,电转化已转入腺病毒骨架载体pAdEasy-1的感受态大肠杆菌BJ5183,经同源重组,构建含有全S基因的重组腺病毒载体pAd/S,后者经酶切充分暴露反向末端重复序列后,与脂质体混合转染AD-293细胞,以获得复制缺陷型重组腺病毒rAd-S。以RT-PCR法检测重组腺病毒rAd-S中TGEV纤突糖蛋白S基因的转录,增强型绿色荧光蛋白（eGFP）荧光检测外源基因的表达,用连续传代和PCR检测rAd-S的稳定性和安全性。为评价重组腺病毒rAd-S对猪的免疫效果,将其灌服或注射28日龄仔猪后,用阻断ELISA检测抗体滴度;60d后进行TGEV强毒攻击,检验其保护力;将所获得抗体与TGEV强毒混合后灌服3日龄乳猪,进一步检测重组腺病毒rAd-S免疫猪后所产生抗体的中和活性;以TGEV强毒攻击灌服重组腺病毒rAd-S免疫母猪的乳汁的3日龄乳猪,检测乳汁免疫对乳猪的保护力。本研究结果如下: 1) 分离了一株TGEV,并通过血清学、电镜鉴定和RT-PCR鉴定,命名为TGEVTS株。 2) 建立了TGEV与PEDV的特异性双重RT-PCR鉴别诊断方法,可直接从腹泻粪样中检测目的基因,为TGEV与PEDV的分子鉴别诊断提供了可行的方法。 3) 克隆的TGEV TS株S基因编码区长度为4350bp,比Purdue株的S基因编码区长6bp,编码1449个氨基酸,与Purdue株核苷酸同源性为98.4%;TGEV TS株N基因长度为1149bp,编码382个氨基酸,与Purdue株核苷酸同源性为98.2%;PEDV QH株M基因长度为681bp,编码226个氨基酸,与CV777株核苷酸同源性为98.5%。 4) 成功构建了含TGEV TS株S基因的重组腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV/S、重组腺病毒载体pAd/S和含TGEV TS株S基因的安全、稳定的复制缺陷型重组腺病毒rAd-S。rAd-S毒价高达1×10-9TCID50/0.2mL,RT-PCR检测表明S基因在转录水平有表达:增强型绿色荧光蛋白检测证实,外源基因获得了表达,为TGEV基因工程疫苗的研究奠定了良好的前期工作基础。 5) 重组腺病毒rAd-S表达的S蛋白具有很好的免疫原性,免疫仔猪后产生的特异性抗体具有中和TGEV的活性,与TGEV强毒混合感作后,能抵御TGEV对3日龄乳猪的感染;重组腺病毒rAd-S免疫产前35天的母猪,所产生的乳汁免疫使极敏感的乳猪对TGEV的攻击具有一定的保护力。

论文目录

• 第一章 绪言
• 1.1 研究背景
• 1.1.1 TGEV的形态结构
• 1.1.2 TGEV分子生物学特性
• 1.2 国内外研究现状
• 1.2.1 TGEV的诊断
• 1.2.2 猪传染性胃肠炎疫苗
• 1.2.3 腺病毒活载体疫苗
• 1.3 研究目的及意义
• 第二章 猪传染性胃肠炎病毒的分离与鉴定
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 菌株与质粒
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 主要仪器与设备
• 2.1.4 病毒分离与培养
• 50的测定'>2.1.5 病毒TCID₅₀的测定
• 2.1.6 中和试验（固定血清—稀释病毒法）
• 2.1.7 病毒电镜观察
• 2.1.8 RT-PCR诊断
• 2.2 结果
• 2.2.1 细胞病变的观察
• 50'>2.2.2 TGEV TS株病毒的TCID₅₀
• 2.2.3 中和试验结果
• 2.2.4 TGEV电镜观察结果
• 2.2.5 PCR产物的电泳结果
• 2.2.6 重组质粒中目的基因PCR鉴定结果
• 2.2.7 目的基因的序列分析
• 2.3 讨论
• 第三章 TGEV和PEDV的双重RT-PCR鉴别诊断
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 菌株与质粒
• 3.1.2 主要试剂
• 3.1.3 主要仪器与设备
• 3.1.4 病毒样品的处理
• 3.1.5 目的基因的双重RT-PCR扩增
• 3.1.6 目的基因的克隆及鉴定
• 3.1.7 基因序列及由其推导的氨基酸序列分析
• 3.1.8 PCR特异性试验
• 3.1.9 敏感性试验
• 3.1.0 田间试验
• 3.2 结果
• 3.2.1 双重PCR产物的电泳结果
• 3.2.2 重组质粒中目的基因PCR鉴定结果
• 3.2.3 TGEV TS株RT-PCR产物序列分析
• 3.2.4 PEDV QH株RT-PCR产物序列分析
• 3.2.5 双重PCR特异性试验
• 3.2.6 敏感性试验结果
• 3.2.7 田间试验结果
• 3.3 讨论
• 第四章 TGEV S基因重组腺病毒的构建
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 技术路线
• 4.1.2 主要材料
• 4.1.3 主要试剂
• 4.1.4 主要仪器与设备
• 4.1.5 S基因的克隆
• 4.1.6 重组腺病毒穿梭载体的构建
• 4.1.7 含S基因重组腺病毒载体的构建
• 4.1.8 含S基因复制缺陷型重组腺病毒的获得
• 4.1.9 重组腺病毒电镜观察
• 4.1.10 重组腺病毒TCID50测定
• 4.1.11 重组腺病毒的稳定性检测
• 4.2 结果
• 4.2.1 S基因PCR产物的电泳结果
• 4.2.2 S基因PCR鉴定结果
• 4.2.3 S基因的序列分析
• 4.2.4 重组质粒pMD18-Ts／S中S基因的鉴定
• 4.2.5 重组腺病毒穿梭质粒的PCR及酶切鉴定
• 4.2.6 复制缺陷型腺病毒质粒的鉴定
• 4.2.7 重组腺病毒的收获及鉴定
• 4.2.8 重组腺病毒电镜观察结果
• 50测定结果'>4.2.9 重组腺病毒空斑纯化及TCID₅₀测定结果
• 4.2.10 重组腺病毒稳定性检测结果
• 4.3 讨论
• 第五章 猪传染性胃肠炎重组腺病毒的动物免疫试验
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 病毒及实验动物
• 5.1.2 主要试剂
• 5.1.3 主要仪器及设备
• 5.1.4 重组腺病毒的准备
• 5.1.5 复制缺陷型重组腺病毒rAd-S对仔猪的免疫效果研究
• 5.1.6 特异性抗体对乳猪的保护力试验
• 5.1.7 乳汁免疫对乳猪的保护力试验
• 5.2 结果
• 5.2.1 仔猪体内rAd-S特异性抗体检测
• 5.2.2 仔猪攻毒试验
• 5.2.3 特异性抗体对乳猪的保护力
• 5.2.4 母猪的血清特异性抗体
• 5.2.5 乳汁免疫对乳猪的保护力
• 5.3 讨论
• 第六章 结论
• 参考文献
• 附录
• 附录1 TGEV Sp基因片段的序列比较
• 附录2 TGEV N基因的序列比较
• 附录3 PEDV M基因的序列比较
• 附录4 TGEV S基因的序列比较
• 致谢
• 作者简历