番茄RNA病毒寄主因子基因ToTOM3的克隆与功能鉴定

论文题目: 番茄RNA病毒寄主因子基因ToTOM3的克隆与功能鉴定

论文类型: 博士论文

论文专业: 植物病理学

作者: 蒙姣荣

导师: 陈保善,李华平

关键词: 寄主因子,基因克隆,番茄,烟草花叶病毒,黄瓜花叶病毒

文献来源: 华南农业大学

发表年度: 2005

论文摘要: 本研究克隆了支持烟草花叶病毒(TMV)和黄瓜花叶病毒(CMV)复制的番茄基因ToTOM3。该基因全长cDNA共有1267个核苷酸,包含一个含888个核苷酸的编码区、72个核苷酸的5′非编码区和307个核苷酸的3′非编码区,编码一个含295个氨基酸、推测是一种七次跨膜蛋白的分子量为34.4 kDa的蛋白质。ToTOM3与拟南芥一个RNA病毒寄主因子基因AtTOM3有76.9%的同源性,与番茄中支持CMV的寄主因子基因ToTOM1有58.6%的同源性。用部分基因组文库结合PCR的方法克隆了ToTOM3基因的全长转录区,共6885bp,包含11个外显子和10个内含子。11个外显子的长度依次为243、91、53、93、72、73、46、64、54、78和400bp。10个内含子的长度依次为2031、155、77、77、654、75、1274、80、333和862 bp。相对定量RT-PCR试验表明ToTOM3基因在番茄子叶期、5叶期、10叶期、结果期等4个生育期的茎、根、叶及结果期的花和果等组织中均有表达,而且表达量基本一致,说明ToTOM3属于组成型表达基因。将ToTOM3基因反义RNA和RNA干扰质粒通过农杆菌介导方法导入番茄,获得26株转基因番茄。Southern杂交表明,这26株转基因番茄的染色体中均携带单拷贝外源基因片段。所有的盆栽转基因番茄均能正常生长、开花和结果。分别用TMV和CMV对5-6叶期转基因番茄和非转基因番茄苗进行接种。用TMV接种10天后,非转基因番茄苗表现出斑驳症状,而转基因苗则无任何症状表现;90天后,接种TMV的非转基因植株仍表现为斑驳症状,而转基因植株无任何症状。苋色藜枯斑定量和DAS-ELISA检测结果显示,所有的转基因植株中TMV均比非转基因对照明显减少,其中,A53中TMV的含量最低,仅相当于对照的7.0%,而A134和R(A)114所含的病毒量最高,相当于对照的52.6%。用CMV接种10天后,非转基因番茄表现出典型的花叶症状,而转基因苗则无任何症状表现;90天后,非转基因番茄苗的叶片严重黄化,形成凹突不平的疱斑,而转基因植株仅表现出轻微的斑驳症状。苋色藜枯斑定量和DAS-ELISA检测结果显示,所有的转基因植株中CMV的含量均比非转基因对照明显减少。不同的转基因株系携带的病毒量有所差异,A25所含的CMV量仅为对照的12.4%,R(A)8为对照的58.1%。高抗TMV的转基因株系同时也高抗CMV。本研究证明,ToTOM3是TMV和CMV共同的寄主因子。同时,本研究也显示,通过抑制寄主因子的表达,可以创造出抗病毒的植物新种质。

论文目录:

摘要

前言

1 番茄 ToTOM3 基因的克隆和序列分析

1.1 材料与方法

1.1.1 材料

1.1.1.1 植物材料

1.1.1.2 菌株与质粒

1.1.1.3 酶、试剂盒和化学试剂

1.1.2 培养基和常用溶液的配制

1.1.3 常规分子生物学操作方法

1.1.3.1 番茄总RNA 的提取纯化

1.1.3.2 番茄总DNA 的提取

1.1.3.3 3′RACE

1.1.3.4 5′RACE

1.1.3.5 PCR 反应

1.1.3.6 PCR 产物的克隆

1.1.3.7 DNA 片段的纯化

1.1.3.8 载体的脱磷酸化处理

1.1.3.9 突出DNA 片段末端的补平

1.1.3.10 DNA 限制性内切酶反应

1.1.3.11 DNA连接反应

1.1.3.12 DNA的转化

1.1.3.13 质粒的提取

1.1.3.14 Southern 杂交

1.1.3.15 菌落原位杂交

1.1.3.16 相对定量RT-PCR

1.2 结果与分析

1.2.1 ToTOM3基因全长cDNA的克隆

1.2.1.1 ToTOM3 基因3′端序列的克隆

1.2.1.2 ToTOM3 基因5′端序列的克隆

1.2.1.3 ToTOM3 基因全长cDNA 的序列

1.2.2 ToTOM3 基因编码蛋白质的氨基酸序列分析

1.2.2.1 ToTOM3 基因编码蛋白质的疏水区域和跨膜结构区域

1.2.2.2 ToTOM3 基因的同源性分析

1.2.3 ToTOM3 全长基因的克隆

1.2.3.1 ToTOM3 全长基因5′端片段的获得

1.2.3.2 ToTOM3 全长基因3′端片段的获得

1.2.4 ToTOM3 基因的结构

1.2.4.1 ToTOM3 基因的内含子和外显子

1.2.4.2 ToTOM3 基因的启动子序列

1.2.5 ToTOM3 基因的时空表达

1.3 小结

2 ToTOM3 基因的功能鉴定

2.1 材料与方法

2.1.1 材料

2.1.2 常规分子生物学操作方法

2.1.3 番茄的遗传转化

2.1.3.1 三亲结合法向农杆菌导入目的质粒

2.1.3.2 无菌苗的获得

2.1.3.3 Flamingo-Bill外植体的转化

2.1.4 转基因植株的扩繁

2.1.5 盆栽

2.1.6 转基因番茄的分子生物学检测

2.1.6.1 PCR 检测

2.1.6.2 Southern 杂交检测

2.1.7 转基因番茄的抗病鉴定

2.1.7.1 磨檫接种法

2.1.7.2 病毒相对含量的测定

2.2 结果与分析

2.2.1 反义RNA 表达质粒的构建

2.2.1.1 反义RNA 表达质粒的构建策略

2.2.1.2 番茄 ToTOM3 全长转录区的 PCR 克隆

2.2.1.3 ToTOM3 基因反义 RNA 表达质粒

2.2.2 RNAi表达质粒的构建

2.2.2.1 RNAi 表达质粒pBIToT3R-A 的构建

2.2.2.2 RNAi 表达质粒pBIToT3R-B 的构建

2.2.3 将表达质粒导入农杆菌 EHA105

2.2.4 转 ToTOM3 基因反义 RNA 和 RNAi 表达质粒的转基因番茄

2.2.5 转基因番茄的分子生物学检测

2.2.5.1 转基因番茄的 PCR 检测

2.2.5.2 转基因番茄的 Southern 杂交分析

2.2.6 转基因番茄对 TMV 和 CMV 的抗性

2.2.6.1 症状表现

2.2.6.2 转基因番茄内TMV 的相对含量

2.2.6.3 转基因番茄内CMV的相对含量

2.2.7 转基因番茄中ToTOM3基因转录水平与抗病性之间的关系

2.3 小结

3. 讨论

3.1 ToTOM3 基因

3.2 保守的TOM 基因家族

3.3 寄主因子—抗病毒基因工程中全新的标靶基因

3.4 转基因番茄的抗病机制

3.5 ToTOM3 在亚细胞结构上的定位

3.6 ToTOM3 的在CMV 复制中的相对活性

4. 结论

致谢

参考文献

英文摘要

附录 A 文献综述正链 RNA 病毒与寄主植物的相互作用

附录 B ToTOM3 基因全长序列及其启动子序列

附录 C 常用培养基和溶液

附录 D 缩略词和英汉对照

发布时间: 2007-11-21

参考文献

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