柿果ACC氧化酶基因cDNA克隆及其植物表达载体的构建

论文摘要

柿果属于跃变型果实，采收后极易软化，给柿果的贮藏运输带来不便。大量研究证实，乙烯是跃变型成熟果实的催熟激素。跃变型果实中自我催化的乙烯合成反应启始后，合成大量乙烯。利用转基因技术抑制或降低果实乙烯的生物合成，可以降低果实乙烯的含量。ACC合成酶和ACC氧化酶是果实乙烯生物合成的限速酶，通过转基因的方法抑制这两种酶的表达，可望提高跃变型果实的耐贮性能。本研究以柿果实为材料，克隆分离了富有柿ACC氧化酶基因，成功构建了该基因的反义和RNA干扰表达载体，结果如下：1．利用Rneasy? Plant Mini Kit试剂盒成功提取了高质量的RNA，RNA的OD260／OD280比值为2.0979，为mRNA的反转录奠定了基础。2．mRNA的反转录采用了QIAGEN公司的反转录试剂盒(OmniscriptTM RT Kit)，分离到完整性好的mRNA，为继后的RT-PCR提供可靠保证。3．根据已发表的平核无柿ACC氧化酶的保守氨基酸序列，设计了一对特异性引物，进行RT-PCR扩增，得到一个长592bp的cDNA片段，经序列分析证明该片段具有ACC氧化酶的保守区氨基酸序列，与GenBank中平核无柿果的DK-ACO1基因核苷酸序列及所编码的氨基酸序列同源性达98％，说明克隆到的片段是富有柿果ACC氧化酶基因片段。4．通过分析已获得ACC氧化酶基因片段，在内含子两端分别设计含有EcoRV酶切位点的引物，通过酶切将两个PCR扩增产物连接成一条基因片段，并转化到大肠杆菌DH5a中经过鉴定及测序，证明得到了去除内含子的基因片段。5．用限制性内切酶XbaⅠ和BamHⅠ酶切克隆到的富有柿果ACC氧化酶核苷酸序列和pBI221质粒载体，将ACC氧化酶的序列反向克隆到了pBI221质粒中，构建成中间表达载体pBI-anti-ACO。6．用SmaⅠ和HindⅢ酶切构建好的中间载体pBI-anti-ACO和pSMAK311质粒，切下中间载体质粒上的CaMV 35S启动子和ACO的反义序列，将其插入到切除CaMV 35S启动子的pSMAK311质粒中，构建成反义表达载体pSMAK-anti-ACO。7．用BamHⅠ和SmaⅠ分别酶切反义中间表达载体质粒pBI-anti-ACO和富有柿果ACC氧化酶核苷酸序列，将ACC氧化酶的序列正向插入到中间载体pBI-anti-ACO质粒中，构建成中间表达载体pBI-ACO-RNAi。8．用SmaⅠ和HindⅢ酶切构建好的中间载体pBI-ACO-RNAi和pSMAK311质粒，切下中间载体质粒上的CaMV 35S启动子和ACO的反义、正义序列，将其插入到切除CaMV 35S启动子的pSMAK311质粒中，构建成RNAi植物表达载体pSMAK-ACO-RNAi。9．利用冻融法将pSMAK-anti-ACO、pSMAK-ACO-RNAi两个表达载体转化到农杆菌EHA101中，经特异性引物对转化菌液进行PCR扩增，证实表达载体已转入农杆菌。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 引言
• 1 柿果贮藏保鲜技术的研究现状
• 2 乙烯与果实成熟
• 3 乙烯生物合成的研究进展
• 3.1 乙烯生物合成与调控过程
• 3.2 乙烯的生物合成基因工程与果实成熟
• 3.2.1 ACC合成酶基因（ACS）与果实成熟
• 3.2.2 ACC氧化酶基因（ACO）与果实成熟
• 3.2.3 SAM水解酶基因、ACC脱氨酶基因与果实成熟
• 4 反义RNA技术
• 5 RNA干扰技术
• 6 本研究的目的、意义
• 第二章 柿果ACC氧化酶基因cDNA片段的克隆
• 1 材料与试剂
• 1.1 植物材料
• 1.2 菌株和载体
• 1.3 试剂及试剂盒
• 1.4 主要仪器
• 1.5 主要试剂溶液的配制
• 2 试验方法
• 2.1 柿果中总RNA的提取及其浓度的检测
• 2.1.1 柿果中总RNA的提取
• 2.1.2 检测RNA的质量与纯度
• 2.2 mRNA的反转录
• 2.3 RT-PCR扩增
• 2.3.1 引物设计与合成
• 2.3.2 RT-PCR扩增
• 2.4 目的扩增片段的回收
• 2.5 目的片段与T载体连接
• 2.6 连接产物的转化
• 2.6.1 感受态细胞的制备
• 2.6.2 连接产物的转化
• 2.7 阳性克隆的鉴定
• 2.7.1 蓝白斑（a-互补）筛选和菌液PCR鉴定
• 2.7.2 碱裂解法小量提取质粒DNA
• 2.7.3 质粒的酶切鉴定
• 2.8 阳性克隆的序列测定及其同源性分析
• 3 结果与分析
• 3.1 柿果中RNA的提取质量
• 3.2 电泳检测RT-PCR产物
• 3.3 菌液PCR鉴定
• 3.4 阳性克隆的酶切鉴定
• 3.5 阳性克隆的序列测定及同源性分析
• 第三章 柿果ACC氧化酶基因片段内含子的去除
• 1 材料与试剂
• 2 试验方法
• 2.1 两个目的片段的PCR扩增
• 2.1.1 引物设计与合成
• 2.1.2 PCR扩增
• 2.2 两个目的片段的酶切、纯化和连接
• 2.2.1 EcoR Ⅴ酶切两个PCR片段
• 2.2.2 酶切产物的纯化
• 2.2.3 酶切产物的连接
• 2.3 连接产物（ACOL）的初步鉴定
• 2.3.1 PCR鉴定
• 2.3.2 酶切鉴定
• 2.4 连接产物（ACOL）的进一步鉴定
• 2.4.1 ACOL与T载体连接
• 2.4.2 连接产物的转化
• 2.4.3 阳性克隆的鉴定
• 2.4.4 阳性克隆的序列测定及比较分析
• 3 结果与分析
• 3.1 电泳检测两个目的片段的PCR扩增产物
• 3.2 连接产物（ACOL）的PCR鉴定及Sac Ⅰ酶切鉴定的电泳检测
• 3.3 电泳检测ACOL的菌液PCR产物
• 3.4 阳性克隆的酶切鉴定
• 3.5 阳性克隆的序列测定及比较分析
• 第四章 柿果ACC氧化酶基因植物表达载体的构建及农杆菌的转化
• 1 材料与试剂
• 1.1 菌株和表达载体
• 1.2 试剂
• 1.3 主要仪器与设备
• 1.4 主要试剂及培养基的配制
• 2 方法
• 2.1 ACC氧化酶基因反义植物表达载体的构建
• 2.1.1 pBI-anti-ACO中间载体的构建
• 2.1.2 pSMAK-anti-ACO表达载体的构建
• 2.2 ACC氧化酶基因RNAi植物表达载体的构建
• 2.2.1 pBI-ACO-RNAi中间载体的构建
• 2.2.2 pSMAK-ACO-RNAi表达载体的构建
• 2.3 构建好的植物表达载体向农杆菌中转化
• 2.3.1 表达载体质粒的大量提取
• 2.3.2 农杆菌（EHA101）感受态细胞的制备
• 2.3.3 表达载体向农杆菌的转化
• 2.3.4 阳性菌落的鉴定
• 3 结果与分析
• 3.1 正义片段与反义片段的PCR扩增
• 3.2 反义植物表达载体的构建及检测
• 3.2.1 pBI-anti-ACO中间载体的构建
• 3.2.2 pBI-anti-ACO中间载体的鉴定
• 3.2.3 pSMAK-anti-ACO表达载体的构建
• 3.2.4 pSMAK-anti-ACO表达载体的鉴定
• 3.3 RNAi植物表达载体的构建及检测
• 3.3.1 pBI-ACO-RNAi中间载体的构建
• 3.3.2 pBI-ACO-RNAi中间载体的鉴定
• 3.3.3 pSMAK-ACO-RNAi表达载体的构建
• 3.3.4 pSMAK-ACO-RNAi表达载体的鉴定
• 3.4 农杆菌中表达载体的菌液PCR鉴定
• 第五章 讨论
• 1 关于柿果ACC氧化酶的研究
• 2 关于ACC氧化酶的基因克隆
• 2.1 柿果组织中总RNA的提取
• 2.2 含有酶切位点的引物设计
• 2.3 温度设置
• 3 关于ACO基因片段内含子的去除
• 4 关于表达载体的构建
• 4.1 表达载体的选择
• 4.2 限制性内切酶的使用
• 4.3 连接片段的浓度比
• 第六章 结论
• 参考文献
• 作者简介
• 致谢
• 附录