中国境内白斑综合征病毒（WSSV）分离株的序列差异分析

论文摘要

白斑综合症病毒（White Spot Syndrome Virus, WSSV）是造成养殖对虾大规模死亡的主要病毒性病原。该病毒是一种大型双链DNA病毒,隶属于Nimaviridae科,迄今为止共有3个WSSV基因组全序列在Genbank上公布,分别为泰国株中国台湾株和中国大陆株。比对这3株全序列发现WSSV基因组中主要的可变区位点的差异方式可分为:缺失,重复单元数量差异,单核苷酸插入或缺失,单核苷酸多态性。本实验中采集到中国境内的13个WSSV地理分离株。设计出了针对每个可变区位点的特异性PCR引物,检测了这些分离株在倾向缺失的可变区位点ORF23/24,ORF14/15和可能的转座酶基因中的序列差异,ORF75,ORF94和ORF125中非同源重复区单向重复单元的数量差异以及重复单元中的SNP。结果显示,中国境内各地的WSSV来源是多重的,传播过程较复杂,通过人为活动传播的可能性较大。各个可变区在进化上是各自独立的。WSSV的致病相关基因主要类型有病毒囊膜蛋白基因,核衣壳蛋白基因,病毒复制过程的关键酶基因,细胞因子受体基因,潜伏相关基因,抑制宿主细胞凋亡机制的基因等,本实验中检测了8个致病相关基因在13个分离株中的序列差异,以及由此导致的蛋白氨基酸差异,结果显示,存在于这8个致病相关基因中的差异共三种情况:单核苷酸多态性,单核苷酸变异,单核苷酸插入。此结果为进一步研究各分离株的毒力差异奠定了基础。在本实验研究过程中,PCR为主要的技术手段,为防止PCR产物遗留污染,在本实验开始阶段曾考虑使用dUTP代替dTTP的dNTP混合物,但在实验过程中发现,使用此方法存在扩增极限长度,经实验证明,此极限长度为1400bp左右,并且在能够扩增的长度范围内,产物长度越长,结果越不稳定,且最适Mg2+浓度越低。鉴于本实验中需准确检测各分离株的序列差异,最终放弃使用dUTP。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言对虾白斑综合征病毒（WSSV）致病相关基因及基因组可变区位点研究进展
• 1 白斑综合征病毒致病相关基因研究进展
• 1.1 囊膜蛋白基因
• 1.2 核衣壳蛋白基因
• 1.3 病毒复制关键酶基因
• 1.4 其它基因
• 1.5 讨论
• 2 白斑综合征病毒基因组可变区位点研究进展
• 2.1 ORF23/24
• 2.2 ORF14/15
• 2.3 可能的转座酶基因（transposase）
• 2.4 同源重复区（homologous regions ,hrs）
• 2.5 VNTR
• 2.6 单核苷酸突变
• 2.7 讨论
• 参考文献
• 第二章 白斑综合征病毒（WSSV） PCR检测中使用含dUTP的dNTP混合物扩增的极限长度
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 PCR引物及程序
• 1.3 使用dUTP扩增极限长度的确定
• 2+浓度变化趋势的确定'>1.4 随扩增长度变化最适Mg²⁺浓度变化趋势的确定
• 2 结果
• 2.1 使用dUTP扩增极限长度
• 2+浓度变化趋势'>2.2 随扩增长度变化最适Mg²⁺浓度变化趋势
• 2.3 Platinum taq 扩增结果
• 3 讨论
• 参考文献
• 第三章 中国境内白斑综合征病毒（WSSV）分离株基因组可变区位点的序列差异分析
• 1 材料与方法
• 1.1 分离株的采集
• 1.2 各分离株DNA 的提取
• 1.3 WSSV的检测
• 1.4 各可变区特异性引物的设计
• 1.5 PCR反应体系及反应程序
• 1.6 PCR产物的纯化
• 1.7 产物克隆及测序
• 1.8 各可变区序列差异分析
• 1.9 基于每个可变区序列构建中国境内分离株的进化关系图谱
• 2 结果
• 2.1 各分离株WSSV检测结果
• 2.2 transposes
• 2.3 ORF23/24
• 2.4 ORF75
• 2.5 ORF94
• 2.6 ORF125
• 2.7 ORF14/15
• 2.8 胸腺嘧啶合成酶基因（TS）
• 2.9 基于各可变区序列构建中国境内分离株的进化关系图谱
• 3 讨论
• 3.1 各可变区位点PCR反应条件的摸索
• 3.2 ORF23/24 中大片段缺失原因的探讨
• 3.3 不同宿主中WSSV分离株可变区的差异
• 3.4 中国各地WSSV的来源与传播途径
• 参考文献
• 第四章 中国境内白斑综合征病毒（WSSV）分离株致病相关基因的序列差异
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料与试剂
• 1.2 待测致病相关基因的选择与引物的设计
• 1.3 PCR扩增体系及反应程序
• 1.4 产物纯化
• 1.5 产物克隆及测序
• 1.6 测序结果分析
• 2 结果
• 2.1 vp281（vp37）
• 2.2 vp28
• 2.3 vp24
• 2.4 wsv366
• 2.5 ORF390
• 2.6 wsv191
• 2.7 vp35
• 2.8 vp19
• 2.9 基于每个致病相关基因序列构建的中国境内WSSV分离株的进化关系
• 3 讨论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 个人简历
• 发表的学术论文