论文题目: 发酵法生产米多霉素的菌种选育、培养条件优化和动力学研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 生物化学工程
作者: 谢志鹏
导师: 岑沛霖,徐志南
关键词: 米多霉素,推理选育,基因组重排,原生质体融合,动力学模型
文献来源: 浙江大学
发表年度: 2005
论文摘要: 米多霉素是一种由链霉菌发酵产生的核苷类抗生素,对真菌细胞具有强烈的抑制及杀死作用,特别是对农作物的白粉病有很好的防治效果,而且具有高效、低毒等特点。米多霉素已经在国外实现商品化生产,我国还未进行研究。本论文以提高发酵法生产米多霉素的水平为目标,对米多霉素发酵的菌种改造、培养基成分和培养条件优化及发酵动力学等进行了深入细致的研究,大幅度提高了米多霉素的产量,为发酵法生产米多霉素的工业化奠定了良好的基础。 本论文取得了如下主要进展: 建立了以红酵母AS2.166为敏感菌、土豆葡萄糖培养基(pH7.0)为检定培养基的米多霉素生物检定法。基于这一生物检定技术,设计出简便易行、成本低廉、省时省力的琼脂块初筛法,并用于米多霉素产生菌的高通量筛选。 根据米多霉素的生物合成途径,对米多霉素野生型产生菌MIL01进行推理选育,获得了一株米多霉素高产菌MIL29,米多霉素产量达到了1010 mg/L,为出发菌株MIL01产量的2.6倍。 对米多霉素产生菌MIL29的原生质体制备和再生条件进行了优化,在最适条件下,原生质体的浓度和再生率均比优化前提高了约1.6倍。考察了不同浓度和不同分子量的聚乙二醇对原生质体融合频率的影响,结果表明,40%的聚乙二醇6000是最适的融合剂,最适融合时间为5min。对MIL29的原生质体进行诱变处理后获得菌株MIL32,米多霉素产量较MIL29提高了约9%。 基于全基因组重排理论,通过两轮的多亲本原生质体融合获得了高产菌株MILS9,米多霉素产量分别比MIL32提高了约77%,达到了1950mg/L。 筛选获得了多种促进米多霉素生物合成的前体物质,其中80mmol/L N,N-二甲基乙酰胺和150mmol/L氯化胆碱组成的复合前体能加快糖、氨基氮的消耗速度和米多霉素的合成速度,促使米多霉素的合成时间提前,将米多霉素产量提高至少12%。利用Plackett-Burman设计法考察了培养基组分和发酵条件对米多霉素生物合成的影响,从10个因素中选出3个对米多霉素生物合成最为重要的因素:玉米淀粉、氯化胆碱和N,N-二甲基乙酰胺。响应曲面分析结果进一步证实了氯化胆碱和N,N-二甲基乙酰胺对米多霉素生物合成具有协同促进作用。在优化后的实验条件下获得米多霉素的摇瓶产量达到2607mg/L,比优化前提高了13%。 在10L搅拌式发酵罐中考察了米多霉素的间歇发酵、分批补料发酵和流加发酵特征。实验表明,分批补料发酵可以解决间歇发酵后期营养物质耗竭所导致的米多霉素合成受限问题,米多霉素产量比间歇发酵提高了约38%。流加发酵
论文目录:
目录
摘要
ABSTRACT
第一章 文献综述
1．1 生物农药与米多霉素
1．2 米多霉素的理化性质及其生物学特性
1．2．1 米多霉素的分子结构
1．2．2 米多霉素的理化性质
1．2．3 米多霉素的用途
1．2．4 米多霉素的安全性
1．3 米多霉素的国内外研究进展
1．3．1 米多霉素产生菌及其生物学特性
1．3．2 米多霉素及相关前体的生物合成途径
1．3．3 米多霉素产生菌的推理选育
1．3．4 生产工艺优化
1．3．5 米多霉素大规模生产技术
1．4 基因组重排技术
1．4．1 前言
1．4．2 代谢工程
1．4．3 DNA重排技术
1．4．4 全基因组重排技术
1．4．5 全基因组重排技术在菌种选育中的应用实例
1．5 抗生素生产动力学模型及其控制
1．5．1 微生物反应动力学研究
1．5．2 丝状菌发酵动力学模型
1．5．3 发酵过程优化控制理论的应用及其发展
1．6 论文的研究思路和研究内容
第二章 材料与方法
2．1 实验材料
2．1．1 米多霉素产生菌及其培养方法
2．1．2 米多霉素标准品
2．2 实验方法
2．2．1 米多霉素的 HPLC分析法
2．2．2 N，N-二甲基乙酰胺
2．2．3 氯化胆碱
2．2．4 还原糖
2．2．5 总糖
2．2．6 氨基氮的测定
2．2．7 菌丝体浓度
第三章 米多霉素的生物检定法
3．1 引言
3．2 材料与方法
3．2．1 材料
3．2．2 方法
3．3 结果与讨论
3．3．1 检定菌的选择
3．3．2 检定培养基的确立
3．3．3 标准曲线的建立
3．3．4 方法的验证
3．3．5 与HPLC分析法的比较
3．3．6 米多霉素对检定菌的效价与对黄瓜粉霉菌的效价的比较
3．4 小结
第四章 米多霉素产生菌的推理选育
4．1 引言
4．2 材料与方法
4．2．1 材料
4．2．2 方法
4．3 结果与讨论
4．3．1 筛选平板培养基
4．3．2 初筛方法的确立和验证
4．3．3 推理选育
4．4 小结
第五章 米多霉素产生菌的基因组重排技术
5．1 引言
5．2 材料与方法
5．2．1 材料
5．2．2 方法
5．3 结果与讨论
5．3．1 原生质体制备和再生条件的优化
5．3．2 原生质体融合剂的选择
5．3．3 原生质体诱变育种
5．3．4 基因组重排育种
5．4 小结
第六章 米多霉素发酵生产条件的优化
6．1 引言
6．2 材料与方法
6．2．1 米多霉素产生菌
6．2．2 斜面培养基
6．2．3 种子培养基
6．2．4 摇瓶发酵培养基
6．2．5 摇瓶发酵方法
6．3 结果与讨论
6．3．1 发酵培养基成分对米多霉素生物合成的影响
6．3．2 前体物质对米多霉素生物合成的影响
6．3．3 Plackett-Burman实验设计法
6．3．4 响应曲面分析法
6．4 小结
第七章 米多霉素的发酵放大技术
7．1 引言
7．2 材料与方法
7．2．1 菌种
7．2．2 种子培养基
7．2．3 发酵培养基
7．2．4 10L发酵罐培养
7．3 结果与讨论
7．3．1 间歇发酵
7．3．2 补料发酵
7．4 小结
第八章 米多霉素产生菌的发酵动力学模型
8．1 前言
8．2 丝状菌的生长机理
8．3 模型的建立
8．3．1 群体生长模型
8．3．2 形态学结构模型
8．3．3 菌丝球宏观模型
8．3．4 完整的模型
8．4 对抗生素发酵过程的拟合
8．4．1 抗生素发酵过程中底物的消耗
8．4．2 发酵过程初始菌体生长状态的估计
8．4．3 发酵过程拟合
8．5 抗生素发酵模型的简化
8．5．1 前言
8．5．2 简化的菌丝形态模型
8．5．3 发酵过程的比生长速率
8．5．4 产物形成
8．5．5 底物消耗
8．5．6 菌丝球模型
8．5．7 完整的模型表达式
8．5．8 米多霉素发酵过程的拟合
8．6 小结
第九章 结论与展望
9．1 结论和创新点
9．1．1 主要结论
9．1．2 创新点
9．2 展望
附录 - 符号说明
致谢
论文发表情况
发布时间: 2006-05-10
参考文献
- [1].新型生物农药米多霉素类化合物的生物合成和活性评价[D]. 叶丹.浙江大学2008
- [2].米多霉素生物合成机理的研究[D]. 李力.上海交通大学2008
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