牛可溶性CD14基因的克隆表达及对脂多糖毒性的保护作用的初步研究

论文摘要

乳房炎是奶牛场中三大常见疾病之一,其中大肠杆菌引起的乳房炎在临床上较为普遍。大肠杆菌型乳房炎病例中8090%表现为临床性,10%发展为急性内毒素性休克,严重时引发死亡。脂多糖（LPS）是革兰氏阴性菌细胞壁的成分。CD14是LPS的细胞表面分子受体,分为膜型CD14（mCD14）和可溶性CD14（sCD14）两类。mCD14分布于单核/巨噬细胞、中性粒细胞表面;sCD14存在于血浆、尿液和奶汁中。对于LPS介导的细胞和信号传导反应是通过LPS、CD14和一种急性期蛋白LPS结合蛋白（LBP）三者相互作用来调节的。大量实验表明sCD14与mCD14竞争结合LPS,在调节由革兰氏阴性菌引起的细菌感染和内毒素性休克中起着重要作用。国外已有一些报道关于应用重组牛可溶性CD14（rbsCD14）分子防治奶牛乳房炎,但国内这方面的具体研究尚几乎处于空白。本研究从大肠杆菌型乳房炎的奶牛全血中分离白细胞,提取总RNA,合成cDNA。根据已发表的牛CD14全基因序列,设计一对牛sCD14特异性引物,通过PCR扩增出目的基因,将其克隆进pMD18-T easy载体,经限制性酶切分析和测序验证,扩增出的牛sCD14片段与预期大小相符（1026bp）。用EcoR I和HindШ将该基因片段从pMD18-T easy载体上切下,回收目的DNA片段,与杆状病毒转移载体pFastBacHTa连接,获得重组转移载体pFastBac-sCD14,转化含有杆状病毒穿梭质粒Bacmid和辅助质粒helper plasmid的大肠杆菌DH10Bac感受态后,通过位点特异性转移获得重组转移质粒pBacmid-sCD14;通过脂质体将重组质粒DNA转染昆虫细胞Sf9,获得携带牛sCD14基因的重组杆状病毒rBac-sCD14。将rBac-sCD14感染昆虫细胞Sf9后,经PCR鉴定pBacmid-sCD14 DNA成功导进Sf9细胞,通过Western blot证实重组牛sCD14蛋白（rbsCD14）在昆虫细胞内得到了表达。并进一步通过金属鏊合层析、透析、PEG浓缩等方法纯化浓缩该蛋白,最终获得约1.1mg重组蛋白。基于上述研究,我们选取BALB/c雌鼠来制造乳房炎动物模型以进一步研究rbsCD14的生物活性。为了研究rbsCD14在体内对于LPS的保护作用,把10只8周龄的BALB/c雌鼠随机分为两组,对照组腹腔注射LPS（8μg/g体重）、PBS,处理组腹腔注射LPS（8μg/g体重）、rbsCD14（6μg/g体重）。注射后24h48h内对照组中5只小鼠全部死亡,而处理中5只小鼠3只死亡。为了研究rbsCD14对小鼠乳房炎的保护作用,对4只经产BALB/c小鼠第4对乳房注射25CFU的E.coli P4,同时,一侧乳房注射rbsCD14（6μg）,对侧乳房注射PBS。与对照组相比,24h后可解剖观察到rbsCD14处理组乳房肿胀和出血症状减轻;通过细菌计数,可见rbsCD14处理组细菌数显著减少。上述试验结果表明:rbsCD14蛋白在体内具有一定的结合或中和LPS的生物活性,能减缓小鼠由大肠杆菌感染引发的乳房炎的严重性。这也提示rbsCD14是一种潜在的治疗大肠杆菌型乳房炎的试剂,能减缓由大肠杆菌等革兰氏阴性菌引起的牛乳房炎。

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文献综述

论文正文牛可溶性CD14 的表达鉴定及对脂多糖毒性的保护作用的初步研究

前言

第一部分牛可溶性CD14 基因的克隆及其杆状病毒表达载体的构建

1. 材料

2. 方法

3. 结果

4. 讨论

第二部分牛可溶性CD14 蛋白在昆虫细胞Sf9 中的表达、鉴定及其对脂多糖毒性的保护性观察