烟草病毒的检测和防治新技术研究

论文题目: 烟草病毒的检测和防治新技术研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 植物病理学

作者: 朱常香

导师: 温孚江

关键词: 烟草病毒病,病毒检测技术,介导的病毒抗性,遗传稳定性,多抗病毒转基因烟草

文献来源: 山东农业大学

发表年度: 2005

论文摘要: 烟草病毒病是全世界烟草栽培区发生普遍,危害严重的一大类病害。目前世界上已报道发现的侵染烟草的病毒达47 种,我国有17 种。在田间,常表现为多种病毒混合侵染,给烟草生产造成重大损失,重病田减产20～50%,夏烟减产70%以上。对病毒病的快速检测和监控技术是病毒病防治的基础性工作,可提高病毒病防治的针对性和时效性;而植物抗病毒基因工程的发展,特别是RNA 介导的病毒抗性策略的提出,为植物病毒病的防治提供了新的途径。围绕着烟草病害的防治,本研究进行了两方面的探索。其一,分离、提纯马铃薯Y病毒(PVY)、黄瓜花叶病毒(CMV)、烟草普通花叶病毒(TMV)、烟草蚀纹病毒(TEV)、马铃薯X 病毒(PVX)、烟草环斑病毒(TRSV),克隆了6 种病毒的外壳蛋白(CP)基因,并进行了序列分析,首次明确了PVY、PVX 和CMV 山东分离物在分类学上的归属地位。制备了不同病毒的抗体和酶标抗体,建立了以点免疫结合技术(DIBA)为基础的快速、多元的病毒检测体系,对山东烟草病毒病进行了初步调查,明确了主要病毒种类。其二,RNA 介导的病毒抗性策略应用于烟草病毒病防治的研究。在已获得不同抗病类型的转非翻译PVY-CP 基因烟草的基础上,研究了RNA 介导的病毒抗性遗传及外源基因的整合方式与RNA 介导的病毒抗性产生的关系,明确了RNA 介导的病毒抗性可稳定地遗传;揭示了转基因的结构对于诱发病毒抗性产生可能起关键的作用,并进而设计了发夹结构DNA 进行了验证。在此基础上,以烟草上危害最为严重的PVY、CMV和TMV 为材料,克隆并构建了包含3 种病毒部分CP 基因的发夹结构DNA 的植物表达载体,转化烟草,首次培育获得了抗3 种病毒转基因烟草。研究结果将为烟草病毒病的防治提供理论依据和技术支持,具有很好的理论和应用价值。具体研究结果如下: 1. 烟草病毒的检测新技术研究—烟草病毒病快速、多元检测技术的建立及应用1.1 病毒的分离从山东感病的烟草和马铃薯上,分离纯化了马铃薯Y 病毒(PVY-SD-TA)、马铃薯X 病毒(PVX-SD1)、烟草花叶病毒(TMV-SD1)、烟草蚀纹病毒(TEV-SD1)、黄瓜花叶病毒(CMV-SD1)和烟草环斑病毒(TRSV-SD1)等6 种烟草上常见的病毒。1.2 病毒外壳蛋白基因克隆及序列分析

论文目录:

中文摘要

英文摘要

符号说明

第一部分 烟草病毒的检测新技术研究——烟草病毒病快速、多元检测技术的建立及应用

1 引言

1.1 指示植物法

1.2 电镜诊断法

1.2.1 负染色法

1.2.2 超薄切片法

1.2.3 免疫电镜技术

1.3 血清学检测方法

1.3.1 酶联免疫吸附法

1.3.2 点免疫结合测定技术

1.3.3 电化学酶联免疫检测

1.4 核酸分子杂交技术

1.4.1 Southern 杂交

1.4.2 Northern 杂交

1.4.3 点杂交

1.5 多聚酶链式反应( PCR)技术

1.5.1 兼并引物PCR 技术

1.5.2 病毒属专化引物 PCR 技术

1.5.3 RT-PCR

1.5.4 实时逆转录PCR

1.5.5 免疫捕捉PCR 技术

1.5.6 PCR-ELISA 定量分析技术

1.5.7 PCR 微量板杂交法

1.5.8 套式PCR

1.5.9 依赖核酸序列的扩增

1.6 双链RNA 技术

1.7 分子灯塔

1.8 免疫毛细管区带电泳仪

1.9 液相色谱/质谱联用仪和基体辅助激光解吸/电离质谱分析仪

1.10 石英晶体微平衡免疫传感器

1.11 本研究的目的和意义

2 材料与方法

2.1 质粒、菌株、酶和试剂

2.2 方法

2.2.1 病毒的来源

2.2.2 病毒提纯

2.2.2.1 马铃薯 Y 病毒(PVY)的提纯

2.2.2.2 马铃薯X 病毒(PVX)提纯

2.2.2.3 烟草花叶病毒(TMV)的提纯

2.2.3 病毒鉴定

2.2.3.1 病毒粒子的电镜观察

2.2.3.2 病毒粒体组织超薄切片观察

2.2.4 RNA 提取

2.2.5 在含有甲醛的凝胶上进行的RNA 电泳

2.2.6 TEV、CMV 和 TRSV 外壳蛋白(CP)基因的克隆

2.2.6.1 引物设计

2.2.6.2 反转录 PCR(RT-PCR)扩增病毒 CP 基因

2.2.6.3 质粒 DNA 的大量提取(碱裂解法)

2.2.6.4 质℃温4 质粒 DNA 和扩增的目的片段的酶切

2.2.6.5 质粒DNA 与目的片段DNA 的连接

2.2.6.6 大肠杆菌BL21 感受态细胞的制备

2.2.6.7 质粒DNA 向大肠杆菌中转化(热激法)

2.2.6.8 转化菌落PCR 及酶切鉴定鉴定

2.2.7 病毒外壳蛋白基因的原核表达

2.2.7.1 蛋白诱导表达

2.2.7.2 SDS-PAGE 分析

2.2.8 病毒抗体及酶标抗体的制备

2.2.8.1 病毒抗血清的制备

2.2.8.2 免疫球蛋白(IgG)的纯化

2.2.8.3 碱性磷酸酶标记病毒抗体

2.2.9 病毒检测技术的优化

3 结果与分析

3.1 病毒的分离与提纯

3.1.1 马铃薯Y 病毒(PVY-SD-TA)的分离和提纯

3.1.2 马铃薯X 病毒(PVX-SD1)的分离与提纯

3.1.3 烟草花叶病毒(TMV)的分离和提纯

3.1.4 烟草蚀纹病毒(TEV-SD1)分离

3.1.5 黄瓜花叶病毒(CMV-SD1)的分离

3.1.6 烟草环斑病毒(TRSV-SD1)的的分离

3.2 病毒外壳蛋白基因的克隆、序列分析

3.2.1 PVY-SD-TA 外壳蛋白基因的克隆和序列分析

3.2.2 PVX-SD1 外壳蛋白基因的克隆与序列分析

3.2.3 TMV-SD1 CP 基因的克隆和序列分析

3.2.4 TEV-SD1 CP 基因的克隆和序列分析

3.2.5 CMV-SD1 CP 基因的克隆和序列分析

3.2.6 TRSV-SD1 CP 基因的克隆

3.3 病毒CP 基因原核表达

3.3.1 CMV-SD1 CP基因在大肠杆菌中的表达

3.3.2 TEV-SD1 CP基因在大肠杆菌中的表达

3.3.3 TRSV-SD1 CP基因在大肠杆菌中的表达

3.4 病毒抗体的制备

3.4.1 病毒抗体免疫球蛋白(IgG)工作浓度的初步确定

3.4.2 酶标IgG 工作浓度的初步确定

3.4.3 抗体特异性测定

3.5 DIBA 检测技术的优化及多元病毒检测体系的建立

3.5.1 汁液稀释浓度、处理方式、添加 EDTA 及反应时间对病毒检测影响

3.5.1.1 病毒汁液稀释浓度的确定

3.5.1.2 PVY、PVX 汁液处理方式对检测效果的影响

3.5.1.3 添加EDTA 对检测效果的影响

3.5.1.4 抗原与抗体(酶标抗体)反应时间对检测效果的影响

3.5.2 多病毒检测体系中各病毒抗体和酶标抗体工作浓度的确定

3.5.3 多元病毒检测体系的确立

3.6 山东烟区烟草病毒种类及比例调查

4 讨论

4.1 CMV 株系划分

4.2 病毒抗血清制备

4.3 CP 基因的克隆

4.4 CP 基因的原核表达

4.5 山东烟区烟草病毒病种群动态变化

5 结论

第二部分 烟草病毒的防治新技术研究—RNA 介导的病毒抗性遗传行为研究及多抗病毒转基因烟草的培育

1 引言

1.1 通过寄主植物的抗病性防治植物病毒病

1.2 通过栽培措施和控制病毒传播介体防治植物病毒病

1.3 依据病毒株系间的交叉保护作用,应用弱毒株系防治植物病毒病

1.4 利用化学药物防治植物病毒病

1.4.1 天然抗病毒剂

1.4.2 合成抗病毒剂

1.5 植物组织脱毒技术在植物病毒病防治中的应用

1.5.1 茎尖分生组织脱毒技术

1.5.2 热处理脱毒技术

1.5.3 茎尖培养和热处理相结合

1.6 植物抗病毒基因工程在植物病毒病防治中的应用

1.6.1 非病毒来源基因介导的抗病性

1.6.1.1 利用植物自身的抗病基因

1.6.1.2 抗体基因工程

1.6.1.3 干扰素

1.6.2 病毒来源基因介导的抗病性

1.6.2.1 利用病毒衣壳蛋白基因

1.6.2.2 利用病毒复制酶基因

1.6.2.3 利用病毒运动蛋白基因

1.6.2.4 利用病毒的反义RNA

1.6.2.5 利用病毒的卫星RNA

1.6.2.6 利用核酶基因

1.6.2.7 利用缺陷干扰型RNA

1.6.2.8 利用RNA 介导的病毒抗性

1.7 本研究的目的和意义

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 毒源

2.1.2 供试材料

2.2 方法

2.2.1 嵌合基因的拼接和hpDNA 构建

2.2.2 转化菌落PCR 及酶切鉴定鉴定

2.2.3 序列测定

2.2.4 植物表达载体的构建

2.2.5 重组植物表达载体向农杆菌中转化(冻融法)

2.2.6 农杆菌介导的外源基因向烟草中转化及转化植株的获

2.2.7 转基因植株的卡那霉素(Km)抗性鉴定

2.2.8 转基因植株的抗病性鉴定

2.2.9 间接ELISA 检测

2.2.10 烟草的DNA 提取(CTAB 法)

2.2.11 转基因植株的PCR 检测

2.2.12 转基因植物的Southern blot 分析

2.2.12.1 植物总DNA 的酶切

2.2.12.2 DNA 凝胶电泳

2.2.12.3 转膜

2.2.12.4 探针的制备

2.2.12.5 杂交

2.2.13 植物总RNA 的提取及Northern 杂交

2.2.13.1 植物总RNA 提取和电泳

2.2.13.2 转膜

2.2.13.3 探针制备

2.2.13.4 杂交

3 结果与分析

3.1 RNA 介导的病毒抗性在转基因烟草中的遗传分析

3.1.1 T1 代转基因植株的遗传和抗病性分析

3.1.2 T2 代转基因植株的遗传和抗病性分析

3.1.3 T3 和T4 代转基因植株的抗病性和mRNA 积累量分析

3.1.4 转基因植株中外源基因的整合方式与 RNA 介导的病毒抗性的关系

3.2 hpRNA 对RNA 介导的病毒抗性产生的影响

3.3 抗PVY、TMV 和CMV 多抗转基因烟草的培育

3.3.1 Hairpin 结构嵌合基因的构建

3.2.2 植物表达载体的构建

3.3.3 转基因植株的获得

3.3.4 转化植株的PCR 检测

3.3.5 转基因植株抗病性分析

3.3.6 转基因植株的Southern blot 分析

3.3.7 转基因植株Northern blot 分析

4 讨论

4.1 RNA 介导的病毒抗性的遗传行为

4.2 转基因拷贝数和转基因结构与RNA 介导的病毒抗性的产生

4.3 多病毒转基因植物的研究

5 结论

5.1 RNA 介导的病毒抗性在转基因烟草中遗传分析

5.2 发夹结构RNA(hpRNA)对RNA 介导的病毒抗性产生的影响

5.3 多抗病毒转基因烟草的培育

6 参考文献

7 附录

7.1 质粒图谱

7.2 常用培养基母液及细菌培养基的配制

7.3 常用抗生素、激素及生化试剂的配制

7.4 常用缓冲液的配制

7.5 克隆的基因序列

7.5.1 PVY-SD-TA CP

7.5.2 PVX-SD1 CP

7.5.3 TMV-SD1 CP

7.5.4 TEV-SD1 CP

7.5.5 CMV-SD1 CP

7.5.6 TRSV-SD1 CP

7.5.7 构建的hpRNA 结构的嵌合基因

8 致谢

9 攻读学位期间发表论文情况

发布时间: 2005-10-11

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