L1-ORF2不同位置串联片段及简单重复序列调节GFP报告基因表达

论文摘要

目的:人类基因组约有40-50%的序列属于重复DNA序列,长散在核元件（long interspersed nuclear elements,LINEs）是其中重要的一种类型。LINEs包括LINE-1（L1）和LINE-2（L2）,前者占据了人类基因组的16.9%。基因组中的L1多数为不完整序列,且大多数L1重复序列在人类基因中以反序形式存在。IL-2基因,T细胞受体基因侧翼含有丰富的L1序列。因为L1在基因组中多数呈不完整片断分布,所以有必要研究L1片段对基因表达的影响。L1-ORF2（L1重复序列第2读码框）按正序方向插入pEGFP-C1（C1）质粒的GFP基因下游,强烈抑制GFP基因表达,反序方向插入则导致GFP转录提前终止,但并不清楚L1-ORF2的这种特性是其整体特征还是由个别片段造成。为了研究L1-ORF2不同片段对上游基因的影响,将来自Xq13.1位置的L1-ORF2（L1PA3家族）不同位置片段（各280bp）及Alu元件（283bp）的8串联体,分别按正、反序方向插入C1质粒,瞬时转染HeLa细胞,Northern杂交和荧光显微镜检测下游序列对GFP基因表达的影响。富含“A”碱基是L1-ORF2的序列特点,“A”碱基含量为40.89%,为了研究富含“A”碱基的简单重复序列是否有正、反序列影响GFP基因表达不同的特征,将736bp的（AAACAAA）n或（AG）n按正、反方向插入C1质粒,观察简单重复序列对GFP基因表达的影响。方法:1重组质粒构建设计5对带合适酶切位点的引物（Table 1）,用RP11-29107克隆作模板,分别扩增5段L1-ORF2片段（各280bp）。PCR扩增片段与C1质粒经酶切和T4 DNA连接酶连接,获得5种插入一个片段的重组质粒。XbaⅠ和NheⅠ的粘性末端可以用T4 DNA连接酶连接,但是连接后不被XbaⅠ和/或NheⅠ切断,利用该特性反复同向串联构建出含8串联片段的重组质粒。将8串联重组质粒插入片段反向插入,筛选出反序重组质粒。构建缺失3’端序列的ORF2（3212bp）片段反向插入表达载体,命名为p280-18as。合成上游带有EcoRⅠ和XbaⅠ酶切位点,下游带有NheⅠ和KpnⅠ酶切位点,中间分别带有AAACAAA或AG简单重复序列的寡核苷酸,引物扩增使其成双链,扩增片段与C1质粒经酶切后连接,串联重复,获得含有正、反序简单重复序列（ 736bp ）的重组质粒,命名为p（AAACAAA）Rep , p（AAACAAA）Repas , p（AG）Rep ,p（AG）Repas。2细胞转染将构建成功的重组质粒和C1质粒分别以脂质体法转染HeLa细胞,37℃、5% CO2环境培养36小时,12孔板细胞用于提取RNA,24孔板细胞用于荧光观察。3 Northern杂交用Trizol提取质粒转染的HeLa细胞总RNA,甲醛变性琼脂糖凝胶电泳,毛细法将RNA转移到尼龙膜。α-32P标记的GFP探针杂交、冲洗后放射自显影。尼龙膜用剥离液处理,冲洗后用检测Neo （neomycin resistance cassette） RNA的探针再次杂交,作为对照。4荧光阳性细胞计数转染质粒的HeLa细胞经4%多聚甲醛固定,×100倍视野白光下计数细胞总数,同样视野紫兰光下计数荧光阳性细胞数,计算荧光细胞阳性率。结果:1重组质粒1.1重组质粒构建构建以下18种重组质粒: p280-1*8as,p280-2*8,p280-2*8as,p280-4*8as,p280-5*8,p280-5*8as,p280-7*8,p280-7*8as,p280-8*8,p280-8*8as, p280-9*8 , p280-9*8as , pAlu*8as , p280-18as ,p（AAACAAA）Rep , p（AAACAAA）Repas , p（AG）Rep , p（AG）Repas。经酶切（Fig.2,Fig.4）,PCR（Fig.3,Fig.4）,测序（Fig.5,Fig.6,Fig.7）鉴定正确。1.2其它重组质粒p280-1*8、p280-4*8、pAlu*8、pORF2及pORF2as为本研究室其它工作构建。本研究所使用的全部质粒及说明见Table 2。2 L1-ORF2不同串联片段和Alu串联序列对GFP报告基因表达的影响2.1 Northern杂交分别用L1-ORF2串联片段和Alu串联正、反序重组质粒转染HeLa细胞,提取总RNA,Northern杂交,结果（Fig.8）显示所有L1-ORF2串联片段中反序GFP基因的表达均高于正序, Alu与L1-ORF2片段不同,正序的GFP基因表达高于反序;不同串联片段转录终止位置不同,p280-1*8、p280-5*8、p280-9*8、p280-1*8as及p280-9*8as发生转录提前终止。2.2荧光阳性细胞计数选择p280-1*8、p280-5*8、p280-9*8及相应的反序分别转染HeLa细胞做荧光显微镜观察（Fig.9）,荧光细胞阳性率均值（±SD）分别为:p280-1*8（1.81±0.87）% , p280-1*8as（14±4.63）% ,p280-5*8（0.51±0.17）% , p280-5*8as（12.5±3.04）% ,p280-9*8（2.54±0.59）%,p280-9*8as（11.96±4.54）%。3 L1-ORF2去除3’端序列后反向插入不发生GFP基因转录提前终止3.1 Northern杂交L1-ORF2反序插入C1质粒（pORF2as）出现转录提前终止。去除L1-ORF2 3’端序列的反序重组质粒（p280-18as）与pORF2as不同,不发生转录提前终止,而是出现转录延伸条带的量高于提前终止性条带（Fig.10）。3.2荧光阳性细胞计数pORF2, pORF2-18as及pORF2as分别转染HeLa细胞做荧光显微镜观察（Fig.11）,荧光细胞阳性率分别为: pORF2（0.16±0.03）% , pORF2-18as （3.93±0.25）%,pORFas（5.45±1.00）%。4简单重复序列对GFP报告基因表达的影响4.1 Northern杂交插入AAACAAA或AG简单重复序列反序的GFP基因转录强度分别高于其正序,且AAACAAA正、反序插入均发生GFP基因转录提前终止（Fig.12）。4.2荧光阳性细胞计数p（AAACAAA）Rep, p（AAACAAA）Repas, p（AG）Rep,p（AG）Repas及C1质粒分别转染到HeLa细胞做荧光显微镜观察（Fig.13）,荧光细胞阳性率分别为: p（AAACAAA）Rep（2.86±0.25）% ,p（AAACAAA）Repas（5.71±0.41）%,p（AG）Rep（2.23±0.47）%,p（AG）Repas（2.86±0.34）%,pEGFP-C1（39±3.67）%。结论: 1所有pEGFP-C1下游插入的序列均抑制GFP基因表达,但是抑制程度和转录终止位置不同。2 L1-ORF2反序出现提前终止,去除L1-ORF2的3’端序列的反序片段不再出现转录提前终止,说明L1-ORF2反序导致的GFP基因转录提前终止是由L1-ORF2的3’端部分序列决定的。3插入AAACAAA、AG简单重复序列反序的GFP基因转录强度高于其正序,说明简单序列在ORF2正、反序影响GFP基因表达特征上起作用。AAACAAA正、反序均引起GFP转录提前终止,说明短的简单重复序列也能调节GFP基因转录终止。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 研究论文 L1-ORF2 不同位置串联片段及简单重复序列调节GFP 报告基因表达
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 附表
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述 真核生物转录终止研究进展
• 致谢
• 个人简历