论文摘要
水稻是世界上重要的粮食作物之一，而水稻病害一直是制约水稻产量的重要因素，孙新立（2004）利用图位克隆法从明恢63中分离克隆了定位于水稻第11染色体上的一个抗病基因Xa3／Xa26基因，同时确定Xa3／Xa26是一个串联排列的多基因家族成员，另有研究表明，多个水稻抗病基因均定位于Xa3／Xa26基因家族相应的染色体区段，这就暗示我们这些尚未鉴定的抗性基因有可能就是Xa3／Xa26基因家族的成员。所以对家族成员的表达分析检测对于发现新的候选抗病基因具有重要意义。本研究采用RT-PCR（Reverse transcription-PCR）的方法对水稻品种特青和日本晴中Xa3／Xa26家族的22个成员进行了表达分析，结果表明特青中的TRka，TRkb，TRkc，TRke在成熟叶片中均为组成型表达，其他成员（TRkd，TRkf，TRkg，TRkh，TRki，TRkj）均不表达；日本晴中的NRka1，NRka2，NRkd2，NRke，NRkf3在成熟叶片中均为组成型表达，其他成员（NRkb1，NRkb2，NRkc1，NRkc2，NRkd1，NRkf1，NRkf2）均不表达。Xa3／Xa26的基因产物编码一个LRR（leucine-rich repeat）受体激酶蛋白，且与抗白叶枯病基因Xa21的编码产物的同源性很高。目前对于该类蛋白质的翻译后修饰位点等生化特性研究尚处于起步阶段。本研究尝试利用酵母表达系统高效表达XA3／XA26融合蛋白，并将该蛋白分离纯化。采用ESI-MS（Electrospray Ionizsation Mass Spectrometry）技术分析蛋白的糖基化现象以及相应的糖基化位点，通过对去糖基化酶处理前后肽段所形成的一级肽指纹图谱的比较，共有五条肽段在两张图谱中均有出现，对这些肽段进行串联二级质谱的测序分析，可以得出位于这些肽段上预测的糖基化位点（N351，N364，N399，N650，N666）均未被糖基化；在去糖基化肽段图谱中还发现有一条差异肽段在原始肽段图谱中未出现，二级质谱测序分析表明该肽段为糖基化肽段，糖基化位点是N869或／和N873。本研究还利用原核表达系统分别表达了特青中Xa3／Xa26基因家族成员TRka部分区段融合蛋白（TRKaP），Xa3／Xa26基因的LRR区融合蛋白（Xa3L／Xa26L）和激酶区融合蛋白（Xa3K／Xa26K），并利用与其融合的His标签进行分离纯化。TRKaP和Xa3L／Xa26L主要是用于制备抗TRKA和XA3／XA26的特异性抗体，利用该抗体可通过免疫染色的方法更加精确的对TRka和Xa3／Xa26进行亚细胞定位。Xa3K／Xa26K可用于对Xa3／Xa26基因的激酶区活性进行检测，通过对Xa3K／Xa26K进行自磷酸化实验，结果发现并没有自磷酸化现象。XA3／XA26和家族中其它两个完整基因MRKa、MRKc的蛋白序列紧靠LRR区段两侧分别都各具有一对半胱氨酸残基，残基间序列遵循保守结构域并且推测可能促使受体蛋白形成二聚体参与信号传导。酵母双杂交结果显示XA3／XA26既没有与自身形成同源二聚体，也没有与MRKa或MRKc形成异源二聚体，表明XA3／XA26蛋白可能是以一个单体或者与XA3／XA26基因家族以外的蛋白形成二聚体的形式发挥作用。这些结果都为我们将来对Xa3／Xa26基因家族的深入研究提供了有价值的信息。