一个新的烟草糖基转移酶的过表达及相关研究

论文摘要

糖基转移酶（glycosyltransferase, GT）广泛存在于原核生物、真核生物、古细菌以及病毒中,能催化糖基从激活的供体转移到特定的受体分子上。GT在调节植物激素水平、抵御外来有害生物侵害或化合物毒害以及调节体内化合物代谢等方面有重要作用。根据GT氨基酸序列的相似度及其催化机制的差异,可将现已知的GT划分为91个家族。由于GT对于植物生命活动的重要性及其潜在的经济价值,已受到人们的广泛关注。本实验室以烟草为材料,克隆了一个受水杨酸（SA）和甲基茉莉酸（MJA）诱导表达的新的GT基因。本研究在此工作的基础上,进一步研究了该基因超表达对烟草植株表型的影响,该基因与GFP基因的融合基因在转化植株中的表达与亚细胞定位,以及该基因在E. coli中的表达和产物初步鉴定。取得了如下研究结果。以克隆的新的GT基因所编码的蛋白质氨基酸序列,在NCBI和Prosite数据库中进行保守结构域分析,结果显示这个酶具有糖基转移酶28家族的保守域和UDP-GT的保守域。经TMPred进行跨膜域分析表明,在该酶蛋白的N端第100-150氨基酸处具有跨膜域;利用CAZy数据库中的GT序列与此GT序列构建系统发育树,在与GT28家族的其它植物GT以及与烟草中其它GT比较后显示,这个糖基转移酶单独构成了一簇。以植物表达载体pCAMBIA1305.1构建了受CaMV 35S启动子驱动的GT基因的超表达载体。将重组载体转化至农杆菌菌株EHA105后,通过叶盘转化法转化烟草,获得了一定数量的转化苗。T0代植株经特异性引物的PCR检测,筛选到了一批阳性转化植株,阳性检出率为40%。经RT-PCR检测,GT基因在多数阳性植株中表达。利用荧光定量PCR检测进一步检测转化植株,筛选到的超表达GT基因植株中,目的基因的表达量较对照提高5-23倍不等。在超表达GT基因的转化植株中,在苗期有不同程度表型变异,其中一株表现出了矮化的性状,且叶片脉络走向、叶表触摸手感均与正常植株明显不同。荧光定量分析显示此GT的表达量是对照的8倍左右。TAIL-PCR扩增获得了T-DNA插入位点的侧翼序列,经NCBI数据库分析并未发现GT基因插入位点侧翼具有已知的基因序列。以植物表达载体pCANMBIA构建了受CaMV 35S启动子驱动的GT基因与绿色荧光蛋白（GFP）基因的融合蛋白表达载体。通过农杆菌介导,叶盘转化法转化烟草,得到了一定数量的转化苗。经PCR检测得到的阳性转化植株,对其中部分阳性植株中融合基因的转录进行了RT-PCR分析。对鉴定的阳性植株进行根尖切片,并经质壁分离后观察到,含GFP的融合蛋白主要定位于根尖细胞的质膜上。通过PCR扩增得到GT基因的ORF序列,与原核表达载体pTYB1连接,构建了重组载体pT。经转化得到的含pT的大肠杆菌菌株ER2566重组子,进行IPTG诱导表达。表达产物经SDS-PAGE分析表明,GT基因在重组子中表达的蛋白分子量大小与预期相符。根据GT基因表达产物只在被检测的各分离组分的沉淀组分中出现,暗示GT蛋白在重组子中以包涵体形式存在。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1.1 糖基转移酶概述
• 1.2 糖基转移酶的生理功能
• 1.2.1 糖基转移酶参与细胞内的稳态调节
• 1.2.2 糖基转移酶参与植物对环境胁迫的响应
• 1.2.3 糖基转移酶参与细胞壁的合成
• 1.3 糖基转移酶特性的应用
• 1.3.1 利用糖基转移酶区域生物催化特性来合成难得到的化合物
• 1.3.2 利用糖基转移酶对植物许多重要经济性状进行改造
• 1.3.3 利用糖基转移酶进行植物修复
• 1.4 烟草中的糖基转移酶
• 1.5 功能基因组时代研究基因功能的方法
• 1.5.1 通过分析基因表达产物来获取有关功能的信息
• 1.5.2 反向遗传学技术
• 1.5.3 生物信息学方法
• 1.5.4 蛋白质组学分析
• 1.6 本实验研究的烟草糖基转移酶
• 1.7 本研究的目的及意义
• 第二章 新的糖基转移酶的生物信息学分析
• 2.1 前言
• 2.2 分析方法软件
• 2.3 结果
• 2.3.1 蛋白基本组成分析
• 2.3.2 蛋白质保守序列分析
• 2.3.3 蛋白质跨膜结构域分析
• 2.3.4 植物糖基转移酶与本基因的系统发育树构建
• 2.4 讨论
• 第三章 GT 基因过表达对转基因植株的影响
• 3.1 前言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 材料、试剂与设备
• 3.2.2 实验方法
• 3.3 实验结果
• 3.3.1 超表达载体的构建
• 3.3.2 超表达载体的烟草转化
• 0 代植株DNA 水平鉴定'>3.3.3 T₀ 代植株DNA 水平鉴定
• 3.3.4 候选植株RNA 水平的检测
• 3.4 讨论
• 第四章 GT 表达产物的亚细胞定位
• 4.1 前言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 材料、试剂与设备
• 4.2.2 实验方法
• 4.3 实验结果
• 4.3.1 亚细胞定位载体的构建
• 0代植株PCR 鉴定'>4.3.2 亚细胞定位载体的烟草转化及T₀代植株PCR 鉴定
• 4.3.3 候选植株RNA 水平的检测
• 4.4 讨论
• 第五章 GT 基因的原核表达
• 5.1 前言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 材料、试剂与设备
• 5.2.2 实验方法
• 5.3 实验结果
• 5.3.1 原核表达载体的构建
• 5.3.2 pT 重组蛋白的表达
• 5.4 讨论
• 参考文献
• 致谢
• 附录 发表的论文目录