外源质粒DNA经胃肠道吸收对小鼠基因表达谱影响的初探

论文题目: 外源质粒DNA经胃肠道吸收对小鼠基因表达谱影响的初探

论文类型: 博士论文

论文专业: 粮食,油脂与植物蛋白工程

作者: 刘建文

导师: 乐国伟

关键词: 外源质粒,胃肠道,吸收,免疫,代谢,基因芯片,基因表达谱,小鼠

文献来源: 江南大学

发表年度: 2005

论文摘要: 外源质粒DNA通过胃肠道途径吸收可达到基因治疗、免疫和代谢调控的目的。外源质粒DNA吸收、基因转移可能对机体造成的影响令人关注。论文研究了外源质粒在胃肠道中的吸收和对机体免疫功能的影响,以基因芯片为技术平台,主要研究外源质粒DNA对机体基因差异表达的影响。主要研究结果如下:1外源质粒DNA在小鼠体内的组织分布及整合的可能性评价实验首先研究外源质粒DNA在小鼠体内的吸收及对整合的可能性进行评价。实验采用5-6周龄,体重20g左右的健康昆明种小鼠,给每只小鼠灌注pcDNA3s质粒溶液200μg,于灌胃后1,3,6,24h,48h及3,6wk分离肺、肾、脾、肠系膜淋巴结、胸腺、生殖器官、粪便、十二指肠、大肠、血液、肌肉及肝脏等。提取组织总DNA,采用半定量PCR法检测外源质粒DNA在不同组织分布及随时间的变化情况。凝胶电泳分离宿主基因组DNA与外源质粒DNA,以组织基因组DNA为模板,PCR法检测质粒DNA在基因组上的整合率。对照模板中加入不同拷贝数的pcDNA3s质粒,确定PCR反应的敏感性。采用氨苄青霉素筛选肠道粪便细菌中的质粒阳性克隆。灌胃质粒pcDNA3s后,可在不同组织、不同时间检测到质粒DNA的存在,至灌胃第6周后,除了肾脏外在其他组织均呈阴性。外源质粒DNA在体内主要以片段形式存在,在各组织基因组DNA中未检测到质粒DNA的整合。未检测到肠道粪便细菌中的质粒阳性克隆,说明在肠道中质粒DNA不会转化到肠道细菌中。结果表明外源质粒DNA能被胃肠道吸收,迅速分布于小鼠各个器官中并以碎片的形式在体内存留较长的时间。外源质粒DNA经胃肠道途径不会整合到宿主染色体基因组上。2外源质粒DNA在小鼠肠道中的吸收机制研究实验采用5-6周龄Balbc/C雄性小鼠6只,随机分成2组,一组为实验对照组,灌胃200μL生理盐水,另一组给小鼠灌胃1μg/μL质粒pcDNA3溶液200μL,灌胃后4h ,分离空肠一段并提取总RNA,RT-PCR逆转录成cDNA,将双链cDNA进行体外转录合成cRNA, cRNA再次反转录成cDNA,Cy5-dCTP标记实验组cDNA,Cy3-dCTP标记实验组cDNA,标记的DNA与芯片进行杂交、洗涤、并进行扫描,采用GenePix Pro4.0进行数据分析。结果显示17667条基因中,一共有4196条基因表达,其中明显差异表达的基因有61条,表达上调36条,表达下调25条。外源质粒DNA可诱导肠道阴离子转运蛋白的表达,提示肠道中可能存在转运蛋白介导外源质粒DNA的吸收。外源质粒DNA进入肠道后能够引起肠道免疫应答基因发生变化。外源质粒DNA上调微粒体谷胱甘肽硫转移酶和谷胱甘肽过氧化物酶的表达,增强肠道的抗氧化功能。外源质粒DNA通过抑制肠道Caspase3基因而抑制肠黏膜细胞凋亡。肠道丝裂原激活蛋白激酶基因(MAP2K2)发生上调,说明外源质粒DNA可能通过MAPK途径激活肠黏膜细胞。

论文目录:

摘要

Abstract

第一章 绪论

1.1 概论

1.2 外源 DNA 在胃肠道中的吸收

1.2.1 外源DNA 能够通过胃肠道途径被机体吸收

1.2.2 外源DNA 在肠黏膜上的吸收机制

1.2.3 外源DNA通过非序列依赖性DNA结合蛋白被细胞吸收

1.2.4 外源DNA 通过胎盘途径转移

1.2.5 外源DNA 整合

1.3 外源质粒 DNA 的生物学特性

1.3.1 质粒pcDNA3 的结构特点

1.3.2 质粒pcDNA3 是一种CpG DNA

1.3.3 CpG 的发现

1.3.4 CpG 的免疫调节功能

1.3.5 CpG 序列的免疫激活机理

1.3.5.1 TLR9 在免疫细胞识别细菌 DNA 时的重要性

1.3.5.2 细菌 DNA 激活免疫细胞的分子机制

1.4 基因芯片技术在营养代谢中的应用

1.5 立题意义

第二章 外源质粒 DNA 在小鼠体内的组织分布及整合的可能性评价

2.1 引言

2.2 材料与方法

2.2.1 实验材料

2.2.2 实验仪器

2.2.3 实验方法

2.2.3.1 质粒的提取纯化

2.2.3.2 动物实验

2.2.3.3 组织总DNA 的提取

2.2.3.4 PCR 扩增检测组织中质粒DNA

2.2.3.5 质粒DNA 整合情况检测

2.2.3.6 粪便中筛选pcDNA35质粒阳性克隆

2.3 结果

2.3.1 pcDNA35 质粒的组织分布

2.3.2 外源质粒pcDNA35 整合宿主基因组

2.3.3 肠道中粪便细菌克隆筛选

2.4 讨论

2.5 本章小结

第三章 外源质粒 DNA 在小鼠肠道中的吸收机制研究

3.1 引言

3.2 方法

3.2.1 实验动物与实验设计

3.2.2 实验方法

3.2.2.1 组织 RNA 的提取

3.2.2.2 对样品 RNA 进行荧光标记

3.2.2.3 杂交与清洗

3.2.2.4 芯片扫描

3.2.2.5 芯片图像的采集与数据分析

3.3 实验结果

3.3.1 总RNA 的质量鉴定

3.3.2 芯片杂交结果

3.3.3 差异表达基因分析

3.4 讨论

3.4.1 外源质粒DNA 肠道离子转运蛋白的推测

3.4.3 外源质粒DNA 对肠道抗氧化和解毒功能的影响

3.4.4 外源质粒DNA 对肠道脂蛋白的影响

3.4.5 外源质粒DNA 与肠道细胞凋亡

3.4.6 外源质粒DNA 在肠道中信号传递途径分析

3.5 本章小结

第四章 外源质粒 DNA 经胃肠道途径对小鼠免疫功能的影响

4.1 引言

4.2 材料与方法

4.2.1 试剂

4.2.2 实验仪器

4.2.3 质粒pcDNA3 的提取及纯化

4.2.4 动物实验及分组

4.2.4.1 实验分组

4.2.4.2 实验1

4.2.4.3 实验2

4.2.4.4 实验3

4.2.5 统计学分析

4.3 结果

4.3.1 外源质粒DNA 对小鼠脏器指数及脾淋巴细胞转化率的影响

4.3.2 外源质粒DNA 对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响

4.3.3 外源质粒DNA 对抗体生成细胞含量、溶血素及免疫球蛋白的影响

4.4 讨论

4.5 本章小结

第五章 外源质粒 DNA 诱导小鼠产生免疫应答的分子机制研究

5.1 引言

5.2 材料与方法

5.2.1 实验材料

5.2.2 主要仪器

5.2.3 分组及方法

5.2.4 总RNA 提取

5.2.5 总RNA 质量检测

5.2.6 cDNA 的合成及纯化

5.2.7 片段化cRNA 的合成及纯化

5.2.8 基因芯片杂交

5.2.9 基因芯片的扫描

5.2.10 数据分析

5.2.11 功能聚类分析

5.3 结果与分析

5.3.1 基因总体表达情况

5.3.2 Mappfinder 功能聚类分析

5.3.3 外源质粒pcDNA3 对免疫相关基因表达的影响

5.4 讨论

5.4.1 外源质粒DNA 对转录因子(Transcription factors)表达的影响

5.4.2 外源质粒 DNA 对 NF-κB 信号通路基因表达的影响

5.4.3 外源质粒DNA 对细胞因子、趋化因子及其受体的影响

5.4.4 外源质粒 DNA 对吞噬相关基因表达的影响

5.4.5 外源质粒 DNA 对内源抗原递呈途径的影响

5.4.5.1 外源质粒DNA 对主要组织相容性复合体表达的影响

5.4.5.2 外源质粒DNA 对蛋白酶体降解途径的影响

5.4.6 外源质粒 DNA 对补体经典途径的影响

5.4.7 外源质粒 DNA 对细胞凋亡相关基因及途径的影响

5.5 本章小结

第六章 外源质粒 DNA 对小鼠脾脏物质能量代谢的影响

6.1 引言

6.2 结果

6.3 讨论

6.3.1 外源质粒 DNA 对核苷酸代谢的影响

6.3.2 外源质粒 DNA 对蛋白质合成的影响

6.3.3 外源质粒 DNA 对脂质代谢的影响

6.3.4 外源质粒 DNA 对电子传递链的影响

6.3.5 外源质粒影响脾脏代谢过程的可能性推测

6.4 本章小结

第七章 外源质粒 DNA 对肝脏急性相应答的调控作用

7.1 引言

7.2 材料与方法

7.2.1 实验动物与实验设计

7.2.2 实验方法

7.2.2.1 肝脏组织 RNA 的提取

7.2.2.2 对样品 RNA 进行荧光标记

7.2.2.3 杂交与清洗

7.2.2.4 芯片扫描

7.2.2.5 芯片图像的采集与数据分析

7.3 实验结果

7.3.1 总RNA 的质量鉴定

7.3.2 芯片杂交结果

7.3.3 生物信息学分析

7.4 讨论

7.4.1 外源质粒DNA 对肝脏急性相应答的影响

7.4.2 外源质粒DNA 对脂质代谢基因的影响

7.4.3 外源质粒 DNA 对信号转导途径的影响

7.5 本章小结

论文的主要结论和创新点

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附录

发布时间: 2006-07-20

参考文献

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