两种贝类抗氧化活性肽的研究

论文摘要

本研究以虾夷扇贝（Patinopecten yessoensis）贝柱及皱纹盘鲍（Haliotis Discus Hannai Ino）为原料,采用蛋白酶水解法制备抗氧化肽。分别采用中性蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶对扇贝贝柱及鲍鱼腹足进行水解。综合考虑体外抗氧化活性、短肽回收率（TCAI）及蛋白酶的反应条件,确定木瓜蛋白酶和中性蛋白酶作为水解扇贝贝柱及鲍鱼腹足的工具酶。通过单因素实验对扇贝贝柱多肽（HSAMs）及鲍鱼腹足多肽（HAFMs）的酶解工艺条件进行优化。以水解度（DH）为评价指标,确定了水解扇贝贝柱的最优条件为温度50℃,pH 7.0,酶加量3500 U/g底物,底物浓度8.0%,水解时间3 h,此时其DH与TCAI分别为28.77%、58.88%；水解鲍鱼腹足的最优条件为温度50℃,pH 7.0,酶加量2500 U/g底物,底物浓度4.0%,水解时间4 h,此时其DH与TCAI分别为27.06%、57.50%。在不同时间酶解两种贝类,对其水解产物的DPPH自由基清除能力、羟自由基清除能力、还原能力及Fe2+螯合能力进行研究。结果表明,在酶解初始阶段,HSAMs的活性随着酶解时间的延长而增强,当酶解25 min时,其DPPH自由基清除能力、羟自由基清除能力、Fe2+螯合能力均达到峰值,IC50值分别为10.27、13.76及0.40 mg/mL。当酶解30 min时,还原能力达到峰值,ACo.5值为11.60 mg/mL。此后,各活性均随着酶解时间的延长而逐渐降低；在整个酶解过程中,HAFMs的活性均随着酶解时间的延长而增加,当酶解180 min时,其DPPH自由基清除能力、羟自由基清除能力、Fe2+螯合能力及还原能力的IC50（AC0.5）值分别为14.83、10.77、0.48及10.93 mg/mL.为了进一步了解HSAMs与HAFMs的抗氧化活性随时间变化的原因,对不同酶解时间所得的两种多肽的分子量分布、氨基酸组成及游离氨基酸含量进行了研究。酶解时间对HSAMs与HAFMs的氨基酸组成没有显著的影响,说明影响活性变化的主要原因不是氨基酸组成。在初始酶解阶段,HSAMs的低分子量组分含量均远高于HAFMs,这是酶解早期HSAMs抗氧化活性更强的原因。随着酶解的进行,HSAMs的0.5 kDa以下组分含量明显增加,这说明其已经过度水解,这是其活性下降的原因；HAFMs则以10 kDa以上的组分相对含量下降为主,0.5 kDa以下组分在水解结束时相对含量仍较低,说明未发生过度水解,这是其活性保持持续上升的原因。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 前言
• 1.2 海洋生物活性肽的来源
• 1.3 海洋生物活性肽的制备方法
• 1.3.1 海洋天然生物活性肽的制备方法
• 1.3.2 海洋生物蛋白水解活性肽的制备方法
• 1.4 海洋生物活性肽的分离纯化
• 1.5 海洋生物多肽的抗氧化活性
• 1.5.1 抗氧化活性肽的来源
• 1.5.1.1 鱼类抗氧化活性肽
• 1.5.1.2 贝类抗氧化活性肽
• 1.5.1.3 其他抗氧化活性肽
• 1.5.2 抗氧化活性肽的活性机理
• 1.5.2.1 氨基酸组成与抗氧化活性的关系
• 1.5.2.2 肽构象与抗氧化活性的关系
• 1.5.2.3 分子量分布与抗氧化活性的关系
• 1.5.2.4 酶的类型及水解度与抗氧化活性的关系
• 1.6 立题背景和意义
• 1.7 本论文研究的主要内容
• 第二章 扇贝贝柱和鲍鱼腹足多肽酶解制备的条件优化
• 2.1 前言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 实验材料
• 2.2.2 实验设备
• 2.2.3 实验方法
• 2.2.3.1 化学组成测定
• 2.2.3.2 扇贝贝柱多肽、鲍鱼腹足多肽的制备
• 2.2.3.3 短肽回收率的测定
• 2.2.3.4 水解度的测定
• 2.2.3.5 DPPH自由基清除能力的测定
• 2.2.3.6 还原能力的测定
• 2.2.3.7 清除羟自由基能力的测定
• 2.2.3.8 单因素试验优化酶解条件
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 扇贝贝柱、鲍鱼腹足的化学组成分析
• 2.3.2 工具酶的选择
• 2.3.2.1 两种贝类水解产物的短肽回收率
• 2.3.2.2 不同酶制备的两种贝类多肽的DPPH自由基清除能力
• 2.3.2.3 不同酶制备的两种贝类多肽的还原能力
• 2.3.2.4 不同酶制备的两种贝类多肽的清除羟自由基能力
• 2.3.2.5 工具酶的确定
• 2.3.3 酶解工艺条件的优化
• 2.3.3.1 水解温度对水解度的影响
• 2.3.3.2 水解pH对水解度的影响
• 2.3.3.3 酶加量对水解度的影响
• 2.3.3.4 底物浓度对水解度的影响
• 2.3.3.5 水解时间对水解度的影响
• 2.4 本章小结
• 第三章 扇贝贝柱及鲍鱼腹足多肽抗氧化活性的影响因素
• 3.1 前言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 原料与试剂
• 3.2.2 实验设备
• 3.2.3 实验方法
• 3.2.3.1 多肽的制备
• 3.2.3.2 水解度的测定
• 3.2.3.3 体外抗氧化活性测定
• 3.2.3.4 肽的分子量切割方法
• 3.2.3.5 分子量分布测定
• 3.2.3.6 多肽的游离氨基酸测定方法
• 3.2.3.7 多肽的总氨基酸测定方法
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 水解时间对水解度的影响
• 3.3.2 不同酶解时间制备的两种多肽的体外抗氧化活性测定
• 3.3.2.1 DPPH自由基清除能力的测定
• 3.3.2.2 羟自由基清除能力的测定
• 3.3.2.3 还原能力的测定
• 2+螯合能力的测定'>3.3.2.4 Fe²⁺螯合能力的测定
• 3.3.3 总氨基酸含量对抗氧化活性的影响
• 3.3.4 分子量分布对抗氧化活性的影响
• 3.3.5 游离氨基酸含量对抗氧化活性的影响
• 3.4 本章小结
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 附录