论文摘要
脑胶质瘤是中枢神经系统最常见的原发性肿瘤,由于恶性胶质瘤呈侵袭性生长,增殖速度快,现有的综合治疗措施如外科手术切除、术后放疗、化疗和免疫治疗难以达到根除,复发率很高,严重影响生存质量和生存期,临床预后甚差。这充分反映了目前对脑胶质瘤的病因,发病机制及其治疗手段认识的匮乏。为此,必须寻找与胶质瘤发生、发展相关的基因和信号通路,深入了解胶质瘤的分子病理机制,在此基础上开拓胶质瘤治疗的新策略和新手段。我室前期应用Atlas cDNA微阵列方法对63例不同类型脑胶质瘤的基因表达谱进行了研究,除进一步证实以往发现的胶质瘤相关基因表达异常外,还发现隔蛋白家族成员SEPT7在胶质瘤中表达显著降低,并经胶质瘤样本初步验证[。在此基础上,我们构建了SEPT7的真核表达载体,将其转染至SEPT7显著下调和缺失的胶质瘤细胞系,观察到SEPT7在体内、外均可抑制胶质瘤生长增殖和诱导凋亡,并具有抑制胶质瘤细胞侵袭的作用；故初步认定SEPT7是一个新的胶质瘤抑癌基因。此外,我们前期研究胶质瘤microRNA表达谱显示,在435个人类microRNA中多个1microRNA表达异常,其中miR-21、miR-221/222、miR-19a/b和miR-30a-5p等microRNA表达较正常组织显著上调。为了寻找可调控SEPT7表达的microRNA,我们搜索了预测microRNA靶基因网站,包括TARGETSCAN, MIRANDA等,发现有50个microRNA,包括miR-19a/b和miR-30a-5P在SEPT7 mRNA 3’UTR上有潜在的结合位点,并且和我室与南开大学数学系合作构建的预测（?）niRNA靶基因的HuMiTar数据库（Ruan J, et al., HumMiTar: A sequence-based method for prediction of human micrRNA targets. Algorithms for Molecular Biology 2008,3：16,国家自然科学基金资助项目“带microRNA调控的胶质瘤细胞信号转导加权网络”,编号A01020403）结果最为一致；故本课题重点研究了miR-19a/b和miR-30a-5p通过调控SEPT7对胶质瘤增殖、细胞周期进展、凋亡和侵袭的影响及其可能的作用机制。本课题研究分为以下三个部分：第一部分中应用Real time PCR的方法,检测了8个胶质瘤细胞系和43例不同级别人脑胶质瘤组织中miR-19a/b和miR-30a-5p的表达水平。结果表明这两个microRNA在胶质瘤中的表达较正常组织显著上调,并与肿瘤级别呈正相关。此外,我们又应用原位杂交技术对75例胶质瘤及5例正常脑组织制备的组织芯片检测两者表达,发现其与Real time PCR检测结果一致。第二部分为miR-19a/b和miR-30a-5p对SEPT7调控的研究。采用Real timePCR鉴定转染反义寡聚核苷酸抑制miR-19a/19b和miR-30a-5p表达的效果；应用荧光素酶报告试验（Luciferase Reporter Assay）检测miR-19a/19b和miR-30a-5p对SEPT7的直接调控关系；鉴于除SEPT7外,miRNA靶基因数据库预测胶质瘤中两个重要的抑癌基因PTEN和P53分别也可能是miR-19a/19b及miR-30a-5p的靶基因,因此我们也用荧光素酶报告实验检测了miR-19a/19b和（?）miR-30a-5p分别对PTEN和P53的直接调控。应用Western blot检测转染（?）miR-19a/19b和miR-30a-5p抑制物（AS-miR-19a/b和AS-miR-30a-5p）后SEPT7表达变化；RT-PCR检测转染AS-miR-19a/b.和AS-miR-30a-5p后SEPT7 mRNA表达变化。结果显示,转染AS-miR-19a/19b和AS-miR-30a-5p后肿瘤细胞miR-19a/19b和miR-30a-5p表达明显下降；SEPT7表达上调；但SEPT7 mRNA表达无明显变化,提示两者仅抑制SEPT7基因转录后的蛋白翻译。共转染AS-miR-19a或AS-miR-19b和带有在SEPT7或PTEN 3’UTR作用区的重组荧光素酶报告质粒pGL3后荧光强度增高,联合转染AS-miR-19a和AS-miR-19b时荧光强度增高更明显；共转染AS-miR-30a-5p和带有在SEPT7或P53 3’UTR作用区的重组荧光素酶报告质粒pGL3后荧光强度也增高。故可推断SEPT7和PTEN是miR-19a/b、SEPT7和P53是（?）niR-30a-5p的靶基因。在课题第三部分,‘将AS-miR-19a/b转染至人脑胶质瘤细胞系SNB19,LN229和U251中、将AS-miR-30a-5p转染至U251,LN308和U87胶质瘤细胞系。为进一步观察miR-19a/b和miR-19a/b的促癌以及SEPT7的抑癌作用,又增设联合敲低SEPT7（SEPT7 siRNA）、PTEN （PTEN siRNA）和P53组（P53 siRNA）以及单独敲低SEPT7组；分别分组如下：对照组（control）,无义序列组（scramble）, AS-miR-19a组,AS-miR-19b组,AS-miR-19a+AS-miR-19b组,SEPT7siRNA组,AS-miR-19a+AS-miR-19b+SEPT7 siRNA （SEPT7 si）组,AS-miR-19a+AS-miR-19b+PTEN si组（仅检测PTEN野生型的LN229细胞系）以及对照组（control）,无义序列组（scramble）, AS-miR-30a-5p组,SEPT7siRNA组,AS-miR-30a-5p+SEPT7 siRNA （SEPT7 si）组,AS-miR-30a-5p+P53 si组（仅检测P53野生型的U87细胞系）。采用Real time PCR检测转染后胶质瘤细胞的miR-19a/b和miR-30a-5p表达水平以鉴定抑制效果；四甲基偶氮唑蓝（MTT）实验评价细胞的增殖率；流式细胞术检测细胞周期变化；Annexin V法检测细胞早期凋亡；Transwell实验检测细胞侵袭能力变化。Real time PCR检测结果显示转染AS-miR-19a/b或AS-miR-30a-5p后,肿瘤细胞AS-miR-19a/b或miR-30a-5p表达下降,AS-miR-19a组,AS-miR-19b组及AS-miR-30a-5p组细胞增殖活性降低,细胞侵袭能力明显受到抑制,细胞周期阻滞在G0/G1期以及早期凋亡增加；AS-miR-19a+AS-miR-19b组效果更明显；转染SEPT7siRNA组则细胞增殖和细胞周期进展加速,侵袭能力增强,而转染AS-miR-19a+AS-miR-19b+ SEPT7 si组和转染AS-miR-19a+AS-miR-19b+PTEN si组；细胞增殖、周期进展、凋亡、侵袭结果无明显差异,与转染AS-miR-19a组或转染AS-miR-19b组结果也无统计学差别；而转染AS-miR-30a-5p+ SEPT7 si组或转染AS-miR-30a-5p+ P53 si组则与control组无明显差异；由此可以进一步推断SEPT7具有明显抑癌作用,与PTEN及P53不相上下；miR-19a/b及miR-30a-5p是癌微RNA （OncomiRs）,可以分别通过负调控抑癌基因SEPT7和PTEN以及SEPT7和P53实现促癌作用。结论：miR-19a/b和miR-30a-5p在胶质瘤中表达上调,正常组织,低级别肿瘤与高级别肿瘤比较,其差异均具有显著性。转染AS-miR-19a/b或AS-miR-30a-5p至人胶质瘤细胞系,可抑制胶质瘤细胞的增殖活性和侵袭能力,G0/G1期出现阻滞,并促进凋亡；而这种生物学行为的改变可能通过miR-19a/b对SEPT7及PTEN的调控和miR-30a-5p对SEPT7及P53的调控实现的。由此,初步认定miR-19a/b和miR-30a-5p为癌微RNA,可成为胶质瘤基因治疗的候选靶标；并进一步认定胶质瘤中SEPT7的抑癌作用和SEPT7下调的机制之一是通过miR的调控实现的。这是首次有关（?）miR-19a/b和miR-30a-5p在人脑胶质瘤中的表达、验证其对SEPT7, PTEN和P53的调控以及对胶质瘤生物学行为的影响的研究报道,为进一步认识脑胶质瘤的分子病理机制及新一类的靶向治疗提供实验依据。
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相关论文文献
- [1].循环miR-19a/b作为心肌缺血再灌注损伤标志物的研究[J]. 中国循环杂志 2017(06)