红曲霉属41个菌株的遗传多样性比较及发酵特性研究

论文摘要

红曲霉是一种非常重要的工业生产用菌,在我国的应用已有上千年历史。用红曲霉发酵可以制成多种传统食品,如红曲米、红曲酒、红腐乳等。现代研究表明红曲霉能够产生多种代谢产物,许多在食品、医药、化工中都非常有用,具有重要的应用价值及良好的应用前景。因此,进行红曲霉属真菌的研究具有十分重要的意义。在研究中,我们通过分离纯化得到41个红曲霉菌株,对这些菌株进行分类鉴定；应用RAPD和ISSR标记对41个菌株进行种质资源研究,揭示了其遗传多样性,比较RAPD和ISSR标记,发现ISSR标记应用于红曲霉中更为稳定且重复性好；通过发酵法研究41个红曲霉菌株产生代谢产物的能力,主要测定其在发酵过程中产淀粉酶、产色素以及产莫那可林K的能力。以41个不同来源的红曲霉菌株为材料,采用MEGA5.10软件对其ITS序列进行分析,构建系统发育树,结合菌落形态特征以及生理生化实验对41株红曲霉进行分类鉴定。实验结果显示41个红曲霉菌株的ITS序列长度为520 bp左右,GC含量在56.27%～58.0%范围内,41个不同序列间的平均遗传距离为0.0052。经分子生物学手段分析,辅以菌落形态观察和生理生化实验,最终将41株红曲霉鉴定为紫色红曲霉（M.purpureus）、从毛红曲霉（M.pilosus）、橙色红曲霉（M. aurantiacus）、红色红曲霉（M.ruber）、烟灰色红曲霉（M.fumeus）和白色红曲霉（M.albidulus）六大类。对分离出的红曲霉用ISSR和RAPD分子标记技术分析研究其遗传多样性,比较2种分子标记方法在红曲霉遗传分析中的优劣,为研究红曲霉遗传多样性奠定基础。采用ISSR和RAPD分子标记方法对来自福建不同地区的41份红曲霉菌株进行遗传多样性分析,筛选出7个ISSR引物和7个RAPD引物；ISSR扩增出多态性条带56条,多态性条带比率为93.33%,菌株间相似系数为0.50-1.00。RAPD引物扩增出多态性条带49条,多态性比率为81.67%,菌株间相似系数为0.62-1.00。用SPSS17.0软件对2种标记遗传距离进行相关性分析,发现2种分子标记结果呈显著正相关,表明2种分子标记方法都适合于红曲霉遗传多样性研究,但ISSR分子标记更适合用于红曲霉分类鉴定,而RAPD更适合用于分析红曲霉种内的不同菌株的差异性。根据RAPD和ISSR两种标记的结果,利用分析软件NTSYSpc-2.10e按照UPGMA方法聚类分析,发现红曲霉具有丰富的遗传多样性,红曲霉种内的遗传距离与地理来源有着一定的相关性。对41个红曲霉菌株分别进行液态发酵法和固态发酵法研究其在发酵过程中产淀粉酶、产色素以及产生理活性物质莫那可林K的能力,以期为红曲霉在各个领域中更好的应用奠定基础。在产色素能力的研究比较中,紫色红曲霉、橙色红曲霉和红色红曲霉相对于丛毛红曲霉、烟灰色红曲霉和白色红曲霉而言,具有更好的产色素能力,而紫色红曲霉相比较橙色红曲霉和红色红曲霉而言,高产红曲色素以及高产各个色素组分的能力更胜一筹,丛毛红曲霉在这6个种中产红曲色素能力最差,同种内的不同菌株产色素能力也差异显著；产淀粉酶能力的研究比较中,紫色红曲霉和橙色红曲霉产淀粉酶能力相对较高,同种内的不同菌株产酶能力各有差别；产MonacolinK的比较分析中,只有丛毛红曲霉种中的部分菌株产生,其他菌种均未产生,说明丛毛红曲霉产MonacolinK的能力在这6个种中独有,但丛毛红曲霉菌种的不同菌株产ManacolinK的能力高低差别很大。结果表明红曲霉的不同种其发酵特性各有差异,并且同一个种其种内的不同菌株的发酵特性也各不相同。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1 红曲霉概述
• 1.1 红曲霉的生物学特性
• 1.2 红曲霉的分类
• 1.3 红曲霉的主要代谢物
• 2 分子生物学方法的应用
• 2.1 DNA分子标记技术
• 2.2 分子生物学在红曲霉研究中的应用
• 3 本研究的目的和意义
• 第二章 红曲霉的分离与鉴定
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果与分析
• 2.1 红曲霉的分离纯化
• 2.2 红曲霉的分子生物学鉴定
• 2.3 红曲霉的菌落形态特征
• 2.4 红曲霉的生化特征
• 3 讨论
• 第三章 红曲霉的RAPD和ISSR分析
• 1 材料与方法
• 1.1 供试菌株
• 1.2 培养基
• 1.3 菌丝培养
• 1.4 试剂和仪器
• 1.5 DNA提取
• 1.6 RAPD和ISSR引物及PCR扩增体系
• 1.7 PCR扩增产物检测
• 1.8 数据分析和统计
• 2 结果与分析
• 2.1 红曲霉基因组RAPD分析
• 2.2 红曲霉基因组ISSR分析
• 2.3 RAPD和ISSR综合分析
• 3 讨论
• 第四章 红曲霉的菌株特性
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果与分析
• 2.1 41株红曲霉产色素能力的比较
• 2.2 41株红曲霉产淀粉酶能力的比较
• 2.3 41株红曲霉产Monacolin K能力的比较
• 3 讨论
• 参考文献
• 附录：41个红曲霉菌株ITS测序结果
• 致谢