稻瘟病菌己糖激酶基因和凋亡抑制蛋白基因的克隆与功能分析

论文摘要

稻瘟病菌（Magnaporthe grisea）是异宗配合的子囊菌,其侵染水稻引起的稻瘟病每年给全世界水稻生产造成巨大损失。了解稻瘟病菌生长发育与致病过程的分子遗传学基础,可以为稻瘟病害控制提供理论指导。在葡萄糖信号转导途径中,己糖激酶（hexokinase,HXK）可作为葡萄糖感受器参与对葡萄糖的感受。本文克隆了编码M.grisea葡萄糖激酶和己糖激酶的基因,分别命名为MgGLK1和MgHXK1。Southem杂交结果显示,MgGLK1和MgHXK1在M.grisea基因组中均为单拷贝。蛋白序列分析表明,它们与其它真菌的同系物亲缘关系较近,而与植物和动物的亲缘关系较远。酵母功能互补分析表明MgGLK1和MgHXK1分别编码具有功能的葡萄糖激酶和己糖激酶。通过基因敲除的方法,发现M.grisea△glk1突变体分生孢子产量较Guy11和△hxk1突变体有明显下降。此外,△glk1突变体在以葡萄糖为碳源的培养条件下会降低对铵盐的利用;而提高葡萄糖浓度或外源加入葡萄糖-6-磷酸（G-6-P）可以恢复△glk1突变体对铵盐的利用。MgGLK1基因与其丧失催化活性的等位基因都能够互补△glk1突变体对铵盐的利用能力。半定量RT-PCR分析结果表明,MgGLK1参与了ATPase基因的转录调控。上述结果表明,MgGLK1作为葡萄糖感受器不依赖于其葡萄糖激酶活性来调节M.grisea对铵盐的利用;且在M.grisea中可能还存在其他的感受器通过感受高浓度G-6-P含量变化来调节对铵盐的利用。凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis protein,IAP）在细胞凋亡过程中起重要的负调控作用。本文克隆了M.grisea凋亡抑制蛋白基因,命名为MgIAP。MgIAP cDNA全长2646 bp,编码881个氨基酸的蛋白。MgIAP蛋白包含两个保守的BIR结构域。系统发育树分析表明,MgIAP与哺乳动物的Survivin、Bruce和果蝇的dBruce亲缘关系最近,而与杆状病毒和哺乳动物的凋亡抑制蛋白亲缘关系较远。对BIR结构域进行亲缘关系分析发现,MgIAP的BIR结构域属于Ⅱ型BIR。Southern杂交结果显示,MgIAP在M.grisea基因组中为单拷贝。MgIAP在酵母中的异源表达,可以抑制氧化压力诱导的细胞死亡及细胞死亡过程中ROS的产生,也可以推迟酵母细胞的时间性衰老及衰老过程中ROS的产生。结构域缺失突变体分析表明,MgIAP的羧基端在推迟酵母细胞时间性衰老中起重要作用。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 上篇 文献综述
• 第一章 己糖激酶在葡萄糖信号途径中的作用
• 1.己糖激酶在动物和植物葡萄糖信号途径中的作用
• 1.1 拟南芥HXK1在植物营养、光和激素信号中的作用
• 1.2 HXK1核复合体在葡萄糖信号中的调控功能
• 2.模式真菌酵母己糖激酶在葡萄糖代谢抑制中的作用
• 3.丝状真菌己糖激酶基因的研究进展
• 参考文献
• 第二章 凋亡抑制蛋白家族在细胞凋亡中的功能研究
• 1.细胞凋亡
• 1.1 细胞凋亡与细胞自噬的区别和联系
• 1.2 细胞凋亡的信号途径
• 2.凋亡抑制蛋白家族（inhibitor of apoptosis proteins,IAPs）
• 2.1 IAPs结构特征
• 2.2 IAPs作用机制
• 2.3 IAPs抑制解除
• 2.4 BIRPs参与调控细胞分裂
• 3.模式真菌酿酒酵母中细胞凋亡的研究
• 3.1 外源物质诱导酵母细胞凋亡
• 3.2 酿酒酵母参与凋亡相关基因的克隆与功能分析
• 3.3 ROS在酵母凋亡中的调控作用
• 4.致病真菌中细胞凋亡的研究
• 参考文献
• 下篇 研究内容
• 第一章 MgGLK1作为葡萄糖感受器参与稻瘟病菌对铵盐的利用
• 1 材料与方法
• 1.1 供试菌株及培养条件
• 1.2 稻瘟病菌DNA、RNA提取和cDNA合成
• 1.3 MgGLK1和MgHXK1基因的克隆与蛋白序列分析
• 1.4 Southern杂交
• 1.5 酵母互补载体构建和酵母功能互补分析
• 1.6 稻瘟病菌基因敲除载体构建和稻瘟病菌原生质体转化
• 1.7 稻瘟病菌转化子验证
• 1.8 稻瘟病菌敲除转化子表型分析
• 1.9 MgGLK1酶活缺失点突变等位基因的构建和功能验证
• 1.10 参与铵盐利用相关基因的RT-PCR检测
• 2 结果
• 2.1 MgGLK1和MgHXK1基因的克隆与序列分析
• 2.2 MgGLK1和MgHXK1在酵母中的功能互补分析
• 2.3 稻瘟病菌MgGLK1和MgHXK1敲除转化子的获得
• 2.4 稻瘟病菌⊿glk1和⊿hxk1突变体的表型分析
• 2.5 MgGLK1通过感受葡萄糖调节对铵盐的利用
• 2.6 葡萄糖浓度影响⊿glk1突变体对铵盐的利用能力
• 2.7 G-6-P含量影响M.grisea对铵盐的利用
• 2.8 MgGLK1作为葡萄糖感受器不依赖其催化活性
• 2.9 稻瘟病菌中参与铵盐利用相关基因的RT-PCR分析
• 3 讨论
• 参考文献
• 第二章 稻瘟病菌凋亡抑制蛋白基因的克隆及在酵母中的功能分析
• 1 材料与方法
• 1.1 供试菌株及培养条件
• 1.2 稻瘟病菌DNA、RNA提取和cDNA合成
• 1.3 MgIAP基因的克隆,蛋白序列与保守结构域分析
• 1.4 Southern杂交
• 1.5 酵母表达载体构建和酵母转化
• 1.6 氧化压力下酵母细胞存活率的测定
• 1.7 酵母细胞衰老分析
• 1.8 酵母细胞中活性氧的检测
• 1.9 MgIAP不同缺失突变体的构建与功能分析
• 2 结果
• 2.1 MgIAP基因的克隆与序列分析
• 2.2 MgIAP的拷贝数分析
• 2.3 MgIAP抑制氧化压力诱导的酵母细胞死亡
• 2.4 MgIAP推迟酵母细胞的时间性衰老
• 2.5 MgIAP羧基端对推迟酵母细胞的时间性衰老是必需的
• 3 讨论
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间发表的论文
• 致谢