微生物法制备（S）-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的研究

论文摘要

在生物催化过程中,氧化还原酶是仅次于水解酶的一大类生物催化剂,以氧化还原酶及其相关的微生物为手性催化剂催化还原潜手性的羰基,可生产手性羟基化合物。本论文以4-氯乙酰乙酸乙酯（COBE）生物不对称还原制备（S）-4-氯-3-羟基丁酸乙酯（S-CHBE）为研究对象,进行了菌种筛选,发酵产酶、转化条件及产物分离提取鉴定的研究,得出了如下结论:建立了气相色谱法进行COBE/CHBE定量分析的方法及手性气相色谱法结合衍生化手段进行CHBE对映体过量值的测定方法。筛选了一株产COBE还原酶稳定、（S）-CHBE的摩尔转化率高和立体选择性好的短梗霉Aureobasidiumpullulans SW0202菌株,确定了最佳的发酵培养基组成（g/L）:麦芽糖30.0,酵母膏20.0,蛋白胨3.0,（NH4）2SO45.0,KH2PO42.0,MgSO4·7H2O 0.7。通过对其发酵条件进行优化,确定了最适温度及pH分别为28℃和pH6.0,最适装液量为70mL/500mL。该菌在此条件下发酵培养24h,产菌丝体生物量16.78g干菌体/L,COBE还原酶酶活力达到1,007 U/L。对A. pullulans SW0202制备光学纯（S）-CHBE的转化条件进行了研究,其优化反应条件为:初始菌体浓度8g/25mL（以湿菌体计）,底物浓度20g/L,pH7.0,温度30℃。在优化条件下,该反应摩尔转化率达到79.6%。另外,还初步研究了固定化短梗霉A. pullulans SW0202细胞进行COBE的不对称还原反应,得出最适固定化方法为卡拉胶包埋法,优化的固定化细胞的转化条件为:加酶量20g/25mL,pH7.0,温度30℃,与游离菌对照的重复利用实验表明,固定化对于维持菌体的转化能力具有一定的作用。此外,以溶剂萃取法、减压蒸馏和硅胶柱层析作为本研究的提取纯化的主要方法,操作简便,分离效果好,适宜于工业化生产,所得产物纯度达98%以上。最后,利用气质联用、核磁共振及旋光仪对产物结构及性质进行了鉴定,证实确为（S）-CHBE。GC测定其纯度为98.23%,比旋光度的测定结果为[α]D20=-20.5（c=0.9028g/100mL,CHCl3）, [α]D20（Aldrich标准品）=-20.8（c=0.9132g/100mL,CHCl3）,核磁图谱分析结果如下:1H-NMR（D2O,400MHz）δ（ppm）,1.31（3H,m,CH3）,2.66（2H,m,CH2COO）,3.63（2H,m,ClCH2）,4.20（2H,m,COOCH2）,4.29（1H,m,CH）。达到生产质量要求。在完成了以上工作的基础上,作者认为该课题仍有一些值得继续深入研究的方面,可通过诱变育种和基因工程改造菌种提高产酶能力,进一步探讨底物流加过程、生物催化剂的固定化改造工艺及尝试利用水-有机相体系的研究。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 1 绪论
• 1.1 手性化合物研究的意义
• 1.2 手性化合物的研究方法
• 1.2.1 手性源法
• 1.2.2 外消旋体拆
• 1.2.3 不对称合成法
• 1.3 生物催化法制备手性化合物
• 1.3.1 生物催化的概念
• 1.3.2 生物催化应用于手性化合物的研究发展
• 1.3.3 生物催化法制备手性化合物的机理
• 1.3.4 利用完整细胞进行生物催化的形式
• 1.3.5 生物催化的特点
• 1.3.6 生物催化的优点
• 1.4 生物催化制备4-氯-3-羟基丁酸乙酯（CHBE）概况
• 1.4.1 产品概况
• 1.4.2 4-氯-3-羟基丁酸乙酯的制备方法
• 1.4.3 国内外技术概况和发展趋势
• 1.4.3.1 手性钌催化剂还原法
• 1.4.3.2 微生物酶催化转化法
• 1.4.4 本课题的来源及研究意义
• 1.4.4.1 本课题的来源
• 1.4.4.2 本课题的研究意义
• 1.4.5 本论文的研究内容
• 参考文献
• 2 COBE 还原酶产生菌的筛选
• 2.1 前言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 材料
• 2.2.1.1 试剂与原材料
• 2.2.1.2 菌种
• 2.2.1.3 仪器与设备
• 2.2.1.4 培养基
• 2.2.2 实验方法
• 2.2.2.1 菌种培养方法
• 2.2.2.2 菌种筛选方法
• 2.2.2.3 菌种的纯化
• 2.2.2.4 COBE 及CHBE 定量分析
• 2.2.2.5 产物CHBE对映体过量值（e.e.）测定
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 COBE 及CHBE 定量分析
• 2.3.2 外消旋的CHBE 的制备
• 2.3.3 产物 CHBE 对映体过量值（e.e.）测定
• 2.3.4 菌种的初筛
• 2.3.5 产酶菌株的复筛
• 2.3.6 菌种的纯化
• 2.3.7 菌种的培养特征观察
• 2.3.7.1 菌体斜面形态的观察
• 2.3.7.2 菌落形态的观察
• 2.3.7.3 细胞形态的观察
• 2.4 本章小结
• 参考文献
• 3 COBE 还原酶产生菌的发酵工艺优化
• 3.1 前言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 材料
• 3.2.1.1 试剂与原材料
• 3.2.1.2 菌种
• 3.2.1.3 仪器与设备
• 3.2.1.4 培养基
• 3.2.2 实验方法
• 3.2.2.1 菌种培养方法
• 3.2.2.2 酶活力测定
• 3.2.2.3 生物量测定
• 3.2.2.4 COBE 及CHBE 定量分析
• 3.2.2.5 产物CHBE对映体过量值（e.e.）测定
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 发酵产酶条件的研究
• 3.3.1.1 碳源的筛选
• 3.3.1.2 氮源的筛选
• 3.3.1.3 复合氮源筛选
• 3.3.1.4 无机盐对菌种产酶的影响
• 3.3.1.5 培养基正交实验
• 3.3.1.6 初始pH 对培养基产酶的影响
• 3.3.1.7 最适发酵温度实验
• 3.3.1.8 摇瓶装液量实验
• 3.3.1.9 菌体生长及产酶实验
• 3.4 本章小结
• 参考文献
• 4 生物催化法还原 COBE 转化条件研究
• 4.1 前言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 材料
• 4.2.1.1 试剂与原材料
• 4.2.1.2 菌种
• 4.2.1.3 仪器与设备
• 4.2.1.4 培养基
• 4.2.2 实验方法
• 4.2.2.1 菌种培养方法
• 4.2.2.2 酶源的获得
• 4.2.2.3 游离细胞转化方法
• 4.2.2.4 固定化细胞的制备
• 4.2.2.5 固定化细胞的转化方法
• 4.2.2.6 COBE/CHBE 浓度分析
• 4.2.2.7 产物 CHBE 对映体过量值（e.e.）测定
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 不对称还原条件研究
• 4.3.1.1 辅助底物的种类对转化的影响
• 4.3.1.2 不同葡萄糖浓度对转化的影响
• 4.3.1.3 底物添加方式的比较
• 4.3.1.4 底物浓度对转化率及对映体过量值的影响
• 4.3.1.5 细胞浓度对转化的影响
• 4.3.1.6 不同温度对转化的影响
• 4.3.1.7 反应体系不同pH 对转化的影响
• 4.3.1.8 转化时间曲线
• 4.3.2 固定化细胞转化条件的初步研究
• 4.3.2.1 用不同包埋方法制备固定化细胞的比较
• 4.3.2.2 固定化细胞的最适添加量实验
• 4.2.2.3 pH 对转化的影响
• 4.3.2.4 温度对转化的影响
• 4.3.2.5 固定化细胞的转化时间曲线
• 4.3.2.6 游离菌与固定化重复利用对照实验
• 4.4 本章小结
• 参考文献
• 5 转化产物 CHBE 的提取纯化及结构鉴定
• 5.1 前言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 材料
• 5.2.1.1 试剂与原材料
• 5.2.1.2 菌种
• 5.2.1.3 仪器与设备
• 5.2.1.4 培养基
• 5.2.2 实验方法
• 5.2.2.1 菌种培养方法
• 5.2.2.2 酶源的获得
• 5.2.2.3 CHBE 的制备方法
• 5.2.2.4 产物提取纯化方法
• 5.2.2.5 纯度测定
• 5.2.2.6 比旋光度的测定
• 5.3 结果与讨论
• 5.3.1 产品的提取
• 5.3.2 产品的纯化
• 5.3.2.1 减压蒸馏
• 5.3.2.2 硅胶柱层析
• 5.3.3 产品鉴定
• 5.3.3.1 CHBE 的旋光度分析
• 5.3.3.2 产物的定性测定
• 5.3.3.3 核磁共振 NMR 分析
• 5.4 本章小结
• 参考文献
• 结论与展望
• 附录
• 致谢
• 硕士期间发表文章