油茶FBPase基因和GAPDH基因的全长cDNA克隆及原核表达分析

论文摘要

油茶（Camellia oleifera）种子含油率较高,是我国南方重要的木本食用油料树种。虽然目前已从油茶中分离出了一些基因,但还有大量基因未被分离鉴定出来,难以满足油茶的品种改良的要求。FBPase和GAPDH是光合作用暗反应中非常重要的调控酶,克隆FBPase基因和GAPDH基因,解析FBPase基因和GAPDH基因的结构和功能,研究FBPase和GAPDH的基因调控机制,有利于揭示油茶光合作用的过程和机理,为提高油茶的光能利用率和油茶产量提供科学依据。为此,我们开展了油茶FBPase和GAPDH的基因克隆、酶结构特点及活性、原核表达的研究,主要研究结果如下：1.油茶FBPase和GAPDH基因的全长克隆。在本实验室已构建的油茶cDNA文库和EST文库的基础上,利用专业软件Primer Premier 5.0设计引物,以油茶优良无性系“湘林1号”的近成熟种子为材料,将提取的RNA反转录后的cDNA作为模板,采用5’RACE技术和3’RACE技术获得了FBPase基因和GAPDH基因的片段,将产物克隆至pMD18-T载体,转化大肠杆菌DH5a菌株,进行测序验证。通过网上BLAST比对测序结果,确认其为油茶的FBPase基因和GAPDH基因的全长cDNA序列,将该2个基因分别命名为co-fbp和co-gapdh。其中,油茶FBPase基因的完整cDNA序列长度为1356 bp, ORF为1023 bp；油茶GAPDH基因的完整cDNA序列长度为1364 bp, ORF为1014 bp。2.油茶FBPase和GAPDH的生物功能预测。应用一系列生物信息学软件分析结合在线软件分析,结果表明：油茶FBPase蛋白分子量为37.7K Da,理论等电点为5.54,其中负电荷氨基酸残基数目为44,正电荷氨基酸残基数目为38,属于稳定蛋白质,有三个比较明显的跨膜区,二级结构分析其有12个α螺旋,其编码蛋白不含二硫键,证明此油茶FBPase基因不受光调控,推测其为胞质FBPase,其活性被AMP所抑制,最佳活性的pH为8.0；油茶GAPDH基因编码的蛋白质理论等电点为5.08,其分子式可写成C3033H5054N101401282S216,油茶GAPDH蛋白质属于不稳定蛋白质,不稳定系数为44.50,该蛋白在大肠杆菌中半衰期大于10个小时,脂肪系数为25.15,平均亲水性0.692,该蛋白没有跨膜区域,二级结构分析其有7个α螺旋。3.油茶FBPase和GAPDH基因的原核融合表达。分别设计了两对特异表达引物,选用限制性内切酶Ndel和HindⅢ,构建了油茶FBPase和GAPDH的融合表达载体pET-28b-FBPase和pET-28b-GAPDH,并成功在大肠杆菌中表达。结果显示：重组油茶FBPase蛋白在IPTG诱导1个小时后出现大量表达,随着诱导时间的递增,表达量有明显增加；重组油茶GAPDH蛋白在加入诱导剂IPTG诱导2个小时后明显表达,随后的3h、4h、5h内,其表达量增加趋势缓和。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 绪论
• 1.1 油茶研究现状
• 1.1.1 油茶概述及研究进展
• 1.1.2 油茶的cDNA文库和EST文库的构建
• 1.2 参与卡尔文循环主要酶的基因工程研究
• 1.2.1 1,5-二磷酸核酮糖羧化酶（Rubisco）
• 1.2.2 甘油醛三磷酸脱氢酶（GAPDH）
• 1.2.3 果糖-1,6-二磷酸酶（FBPase）
• 1.2.4 3-磷酸甘油酸激酶（PGK）
• 1.2.5 丙糖磷酸异构酶（TPI）
• 1.2.6 果糖-1,6-二磷酸醛缩酶（ALD）
• 1.2.7 景天庚酮糖-1,7-二磷酸酶（SBPase）
• 1.2.8 转酮酶（TKL）
• 1.2.9 核酮糖-5-磷酸-3-表异构酶（RPE）
• 1.2.10 核糖-5-磷酸异构酶（RPI）
• 1.2.11 磷酸核酮糖激酶（PRK）
• 1.3 本研究的目的意义
• 1.4 本研究的主要内容和技术路线
• 2 油茶FBPASE基因的CDNA全长克隆与原核表达
• 2.1. 实验材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 载体与菌株
• 2.1.3 药品与试剂
• 2.1.4 主要软件与仪器
• *表示需要高压灭菌处理,下同）'>2.1.5 培养基与配制溶液（^*表示需要高压灭菌处理,下同）
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 油茶FBPase基因的cDNA全长克隆
• 2.2.2 油茶FBPase基因的生物信息学研究
• 2.2.3 油茶FBPase基因的原核表达研究
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 油茶FBPase基因的全长cDNA克隆
• 2.3.2 油茶FBPase基因的生物信息学分析
• 2.3.3 油茶FBPase基因的原核表达研究
• 2.4 小结与讨论
• 2.4.1 油茶种子胚乳RNA提取结果
• 2.4.2 RACE技术
• 2.4.3 生物信息学分析
• 3 油茶GAPDH基因的CDNA全长克隆与原核表达
• 3.1 实验材料
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 油茶GAPDH基因的cDNA全长克隆
• 3.2.2 油茶GAPDH基因的生物信息学研究
• 3.2.3 油茶GAPDH基因的原核表达研究
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 油茶GAPDH基因的全长cDNA克隆
• 3.3.2 油茶GAPDH基因的生物信息学分析
• 3.3.3 油茶GAPDH基因的原核表达研究
• 3.4 小结与讨论
• 3.4.1 生物信息学分析
• 3.4.2 原核表达引物设计
• 3.4.3 目的蛋白的诱导表达
• 3.4.4 PAGE电泳
• 4 结论与创新点
• 4.1 结论
• 4.2 创新点
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间主要的研究成果
• 致谢