论文摘要
背景与目的白血病的发生、治疗中耐药乃至白血病复发的根本原因在于患者体内存在着一群白血病干细胞（LSC）。它跟正常的干细胞一样具有自我更新和分化潜能。它在全血细胞中仅占0.25-1.0%。传统的白血病治疗通常是细胞毒药物的联合化疗配合造血干细胞移植,然而这种方法选择性差,在杀伤肿瘤细胞的同时也损害体内某些类型的正常细胞,而且只能杀死大部分已分化的肿瘤细胞不能杀死肿瘤干细胞,因此造成肿瘤治疗效果的不理想。所以,只有靶向肿瘤干细胞的治疗才能使恶性肿瘤治愈。在白血病干细胞表面具有一些不同于正常干细胞的表面标志。针对这些表面标志的靶向治疗将有效地靶向肿瘤干细胞而对正常干细胞没有任何损伤。研究发现CD123是AML干细胞所特有的表面标志,其在正常造血干细胞（CD341,CD38-）的表达<1%,而在急性髓系白血病干细胞的的表达>99%。除此之外,CD123在其他白血病细胞的表面也有表达。人白细胞介素3（IL-3）是CD123的配体,是造血干细胞增殖分化的正性调节因子,可刺激多能干细胞和多种祖细胞的增殖与分化。IL-3还可增强白血病细胞对某些化疗药物敏感性,能选择性地诱导白血病细胞进人细胞周期,使周期特异性化疗药物对急性粒细胞白血病（AML）细胞的毒性增强。此外IL-3还可与IL4协同作用,促进T淋巴细胞前体细胞的发育,诱导CD4+T淋巴细胞自分泌生长,IL3可直接或间接地影响细胞毒T淋巴细胞的成熟和增殖。基于外周血淋巴细胞（Peripheral blood lymphocyte, PBL）的生物治疗已经成为重要的抗肿瘤策略之一。PBL中的T细胞可以通过与肿瘤细胞接触形成T细胞-肿瘤细胞突触样结构,直接对肿瘤细胞发挥细胞杀伤作用。然而,T细胞识别过程的复杂给肿瘤细胞提供了很多机会来逃逸T细胞对其特异性识别,因此肿瘤细胞得以存活并增殖。CD3是T淋巴细胞表面特异分子,通过它可以募集具有杀伤作用的T淋巴细胞。本实验基于此构建了抗CD3抗体的Fv与IL3融合形成的抗CD3-IL3融合蛋白,并且通过改造获得了表达量高、稳定性好的抗CD3-m2IL3,抗CD3-⊿IL3融合蛋白。为增强抗CD3-m2IL3,抗CD3-⊿IL3融合蛋白的稳定性,在VL间VH引入了人二硫键,表达并纯化后测定它们体外生物学活性和介导效应细胞杀伤靶细胞的作用。方法用重叠PCR （Overlap PCR）和PCR方法,构建抗CD3/IL3表达载体pAYZCD3/IL3,再用PCR法通过引物在抗CD3VL-100位和抗CD3VH-44位引入半胱氨酸突变,构建二硫键稳定的抗CD3/IL3表达载体pAYZCD3*/IL3,转化感受态大肠杆菌16C9进行原核表达。表达产物经6×His-tag亲和层析柱分离纯化,12%SDS-PAGE电泳及westen-blot鉴定。用同样的方法表达抗CD3*/m2IL3、抗CD3／m2IL3,抗CD3*/⊿IL3及抗CD3/⊿IL3融合蛋白。应用间接免疫荧光和竞争性免疫荧光结合流式细胞分析技术（FACS）检测抗CD3*/m2IL3.抗CD3/m2IL3,抗CD3*/⊿IL3及抗CD3/⊿IL3融合蛋白与CD123+ M07e细胞和CD3+ Jurkat细胞的结合活性,将4种融合蛋白在0.2%的人血清白蛋白中37℃温育不同时间点至72h后,通过间接免疫荧光法FACS检测其结合活性,并比较二者的稳定性。利用非放射性荧光染料Calcein-AM进行抗体介导的体外特异性杀伤活性检测,Ficoll-Hypaque法分离外周血淋巴细胞（PBL）作为效应细胞,首先以TF1细胞或M07e或AML病人干细胞(CD34+CD38-CD123+为靶细胞,按不同效靶比,不同抗体浓度设组,以PBS,抗CD3/抗CD19双功能抗体为对照,另设CD123一的k562细胞为非相关靶细胞组,比较融合蛋白介导的特异性体外杀伤活性。取上述杀伤实验效靶比25：1,融合蛋白浓度500ng/ml各组,实时定量PCR检测各组穿孔素（Perforin）和颗粒酶A（Granzyme A）的释放。结果基因重组质粒pAYZCD3*/IL3.pAYZCD3/IL3.pAYZ CD3*/m2IL3.pAYZ CD3/ m2IL3,pAYZCD3*/⊿IL3及pAYZCD3/⊿IL3经测序证实序列正确,构建成功。抗CD3*/IL3在原核表达系统中进行可溶性表达过程中发现,表达产物经6×His-tag蛋白纯化柱纯化,浓缩后,12%SDS-PAGE显示在27kD,30KD和57kD各有一条带,但western-blot显示在30KD和57kD均有带,与预测结果一致。但后续实验发现pAYZCD3*/IL3.pAYZCD3/IL3的稳定性差,极易发生沉淀和降解。流式检测发现该蛋白与CD3单抗HIT3A有竞争活性,但与抗CD123单抗竞争活性很弱；ELISA检测结果发现,纯化蛋白中活性IL3的含量很低,约为蛋白定量结果的104分之一,所以我们推测IL3的一端发生了断裂或蛋白构象发生了变化。改造后的抗CD3*-m2IL3、抗CD3*-⊿IL3非还原性SDS-PAGE中,在57KD、30kD和27KD有条,western-blot在57KD和30KD显示有带；还原性SDS-PAGE显示57KD带消失,在30kD和27kD各有一条带,western-blot在30kD显示有带,这些均与理论相符。57KD为二硫键稳定的二聚体,在还原剂巯基乙醇作用下二硫键断开,形成30kD和27kD的2条带。表达产物经纯化定量抗CD3*-m2IL3可达1mg/L,抗CD3*-⊿IL3可达2mg/LFACS检测四种融合蛋白均可与CD123+M07e细胞和CD3+Jurkat细胞特异结合,并能竞争性抑制单抗AntiCD123和HIT3a与上述细胞的结合。体外血清稳定性实验结果抗CD3*-m2IL3、抗CD3*-⊿IL3 37℃72h后活性基本不变,而抗CD3-m2IL3、抗CD3-⊿IL3则递减至消失,证明引入二硫键可增加蛋白的稳定性。抗CD3*-m2IL3、抗CD3-m2IL3、抗CD3*-⊿IL3、抗CD3-⊿IL3体外介导T细胞杀伤靶细胞TF1、M07e细胞的效果比对照组明显（p<0.05）,激活T细胞释放Perforin和Granzyme A的量均明显高于对照组（p<0.05）。结论本实验成功构建了pAYZCD3*/IL3、pAYZCD3/IL3、pAYZ CD3*/m2IL3、pAYZ CD3/m2IL3,pAYZCD3*/⊿IL3及pAYZCD3/⊿IL3的表达载体并获得了可溶性表达,改造后的抗CD3*/m2IL3、抗CD3/m3IL3,抗CD3*/⊿IL3及抗CD3/⊿IL3,其稳定性或活性均有明显提高。二硫键稳定的CD3*-m2IL3、抗CD3*-⊿IL3融合蛋白与抗CD3/ m2IL3,抗CD3/⊿IL3相比稳定性有明显提高,且抗原结合活性和体外介导T细胞发挥杀伤效应的能力没有明显改变。
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