疾病蛋白标志物与基因突变检测电学式生物传感器新方法研究

论文摘要

随着生物传感器在环境、食品、医药和军事等方面应用范围的扩大,因而吸引了众多研究者的兴趣。为了获得高灵敏度、再生性好、低成本的生物传感器,我们对此做了相关研究。本论文主要基于电化学和压电晶振技术,设计建立了几种新型生物传感器技术,实现肿瘤及遗传病的准确、快速、简便的检测。主要内容如下:（1）报道了一种新型的基于压电免疫凝集的肿瘤标志物——人血清甲胎蛋白（AFP）的快速传感技术。此方法的基本原理是表面修饰了兔抗AFP多克隆抗体的纳米脂质体可与多价抗原AFP发生特异性免疫识别,诱导免疫脂质体产生特异性凝集反应,并引起溶液粘度变化,该粘度变化可采用压电传感器的响应频率变化而进行监测。为了消除干扰蛋白质成份的非特异性吸附,可用牛血清白蛋白（BSA）修饰压电传感器表面,并在分析介质中引入高浓度BSA以降低背景干扰。我们考察脂质体的组成,分析介质中脂质体浓度与聚乙二醇（PEG）浓度等的影响。结果表明,当人血清AFP的浓度在0.06-5μg mL-1时,该压电免疫传感器的频移与AFP的浓度成线性关系,检测下限为60 ng mL-1。（2）我们提出了一种新型基于脂质体界面凝集、对霍乱毒素的快速检测压电生物传感器。我们首先在金电极表面修饰一层长链烷烃硫醇,然后在表面铺展饰有神经节苷脂的支撑磷脂膜。当存在霍乱毒素时,霍乱毒素会被晶振表面的神经节苷脂捕获和溶液中磷脂液泡的神经节苷脂捕获,从而产生特异性凝集反应。这样溶液的密度和粘度变化,而且会增强石英晶振表面质量响应变化,最终石英晶振的响应频率会大幅降低。除了通过响应频率来量化霍乱毒素,我们也可以通过初始阶段的响应频率速度（△F/△S）来检测霍乱毒素。响应频率速度在快速检测实验有着特殊的意义。该方法对霍乱毒素的检测范围是0.1-5μg mL-1,检测下限为25ng mL-1。支撑磷脂膜不但对人血清蛋白没有吸附,而且能够迅速再生。（3）MutS蛋白是DNA修复系统中的一个重要部分,它能够准确的识别并结合所有的单碱基错配,以及1-4碱基插入和缺失形成的不依赖于其它蛋白质或辅助因子的各种结构的Loop环。我们利用MutS蛋白能够特异性结合单碱基错配双链DNA和亚甲基蓝只嵌入双链DNA的特点,建立了一种新型电化学单碱基突变检测方法。因为MutS只与单碱基错配双链DNA特异性结合,这种检测方法的背景很低。该方法成功地实现了β-地中海基因的-28位点的单个碱基突变的识别,且检测限达到5.66×10-13M,此方法对点突变的检测具有快速、高灵敏度、成本低的特点。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
• 1.1 生物传感器
• 1.1.1 生物传感器的基本组成和工作原理
• 1.1.2 生物传感器的分类
• 1.1.3 生物传感器中生物分子的固定化方法
• 1.1.3.1 物理吸附固定法
• 1.1.3.2 包埋固定法
• 1.1.3.3 定向固定法
• 1.1.3.4 交联法
• 1.1.3.5 自组装法
• 1.1.3.6 LB 膜技术
• 1.1.3.7 纳米粒子构建传感器的活性界面
• 1.2 压电免疫生物传感器
• 1.2.1 压电免疫传感器理论基础
• 1.2.2 压电生物传感器的分类
• 1.3 电化学DNA 传感器
• 1.3.1 电化学DNA 传感器的分类
• 1.3.2 电化学DNA 传感器分析展望
• 1.4 单碱基多态性
• 1.4.1 单碱基突变的检测方法
• 1.5 本研究工作的构思
• 第2章 一种新型的甲胎蛋白压电免疫凝集传感技术
• 2.1 引言
• 2.2 实验部分
• 2.2.1 仪器与试剂
• 2.2.2 缓冲溶液的制备
• 2.2.3 脂质体的制备
• 2.2.4 脂质体表面标记抗体
• 2.2.5 对石英晶振探针界面的修饰
• 2.2.6 检测过程
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 不同修饰界面下的频率响应
• 2.3.2 分析介质的优化
• 2.3.3 人AFP 血清样品测定
• 2.4 小结
• 第3章 基于脂质体界面凝集的压电生物传感器对霍乱毒素的快速检测
• 3.1 前言
• 3.2 实验部分
• 3.2.1 仪器与试剂
• 3.2.2 修饰了神经节苷脂的脂质体的制备方法
• 3.2.3 压电传感表面修饰支撑磷脂膜
• 3.2.4 压电传感界面的分析方法
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 压电石英晶振的频率响应
• 3.3.2 压电传感器的频率响应的特征分析
• 3.3.3 优化分析介质中的神经节苷脂修饰的脂质体浓度
• 3.3.4 压电生物传感器对霍乱毒素的检测
• 3.3.5 传感器的再生
• 3.4 小结
• 第4章 错配识别蛋白MutS 用于DNA 中点突变的电化学检测
• 4.1 前言
• 4.2 实验部分
• 4.2.1 仪器与试剂
• 4.2.2 溶液
• 4.2.3 金溶胶的制备
• 4.2.4 DNA 生物传感器的制备
• 4.2.5 测量过程
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 点突变检测原理
• 4.3.2 电化学阻抗表征电极表面
• 4.3.3 缓冲溶液和反应时间的优化
• 4.3.4 点突变的测定
• 4.4 小结
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 附录A 攻读硕士学位期间所发表的学术论文