病毒粒子以及病毒和宿主相互作用的蛋白质组学分析

论文摘要

病毒蛋白质组学是指运用蛋白质组学方法对病毒蛋白质组成以及病毒和宿主相互作用进行系统性分析。本论文综合运用不同的蛋白质组学技术路线,对棉铃虫核型多角体病毒两种不同病毒粒子的蛋白质组成以及日本乙型脑炎病毒感染后宿主的蛋白质组变化进行了详细分析。杆状病毒（baculovirus）在其生活周期中会产生两种病毒粒子：出芽型病毒（budded virus, BV）粒子和包涵体型病毒（occlusion-derived virus, ODV）粒子。ODV主要进行口服感染,而BV主要在宿主体内进行水平传播。我们运用多种蛋白质组学方法对α杆状病毒模式株之一的棉铃虫核型多角体病毒（Helicoverpa armigera nucleopolyhedrovirus, HearNPV）两种病毒粒子的蛋白组成、蛋白相对位置和蛋白质翻译后修饰进行了研究。我们在两种病毒粒子上一共鉴定到77种HearNPV蛋白,并对其中54种蛋白进行了定位。我们的研究表明,BV和ODV共有的蛋白主要和核衣壳的组装以及运输有关；两种病毒粒子的膜蛋白差别较大,其中BV特有的膜蛋白和膜融合等过程有关,而ODV特有的膜蛋白主要和口服感染有关。此外,两种病毒粒子的翻译后修饰差别也较大,其中我们只在BV中鉴定到糖基化位点,ODV中没有鉴定到。我们的研究为两种病毒粒子不同功能的解析提供了新的启示。日本乙型脑炎病毒（Japanese encephalitis virus, JEV）在宿主细胞内进行复制的过程中,需要借助宿主蛋白完成复制,而宿主自身免疫系统会被激活。为了研究JEV对宿主细胞的影响,我们首次运用基于SILAC的亚细胞定量蛋白质组学技术对JEV感染的HeLa细胞进行了分析。我们发现158种宿主蛋白受JEV入侵的调控,生物信息学分析表明这些蛋白主要为免疫应答、泛素-溶酶体系统、内膜系统以及脂类代谢相关蛋白,表明这些生物过程受JEV入侵影响较大。通过siRNA技术,我们对8种JEV调控的宿主蛋白进行了功能分析,发现其中4种蛋白（IFITM3, RANBP2,SAMD9和VAMP8）的表达量下降后,细胞内JEV的含量降低。通过我们的研究,我们对JEV入侵后宿主细胞的反应有了更好的了解；此外我们还发现了4种潜在的抗JEV因子,为以后针对这些蛋白的抗病毒研究提供了帮助。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 目录
• 第一章 绪论
• 1. 基于质谱的蛋白质组学
• 1.1 蛋白质组学简介
• 1.2 生物质谱技术
• 1.2.1 离子源
• 1.2.1.1 基质辅助激光解析离子化（MALDI）
• 1.2.1.2 电喷雾离子化（ESI）
• 1.2.2 质量分析器和离子检测器
• 1.2.2.1 四级杆质量分析器（quadrupole,Q）
• 1.2.2.2 飞行时间质量分析器（time offlight,TOF）
• 1.2.2.3 离子阱质量分析器（ion trap,IT）
• 1.2.2.4 傅里叶变换-离子回旋共振质量分析器及Orbitrap质量分析器
• 1.3 基于质谱的蛋白质组学研究
• 1.3.1 蛋白质的鉴定
• 1.3.1.1 自下而上（Bottom-up）鉴定蛋白的策略
• 1.3.1.2 自上而下（Top-down）鉴定蛋白的策略
• 1.3.1.3 蛋白质组学分离技术
• 1.3.2 蛋白质翻译后修饰的蛋白质组学研究
• 1.3.2.1 磷酸化蛋白质组学研究
• 1.3.2.2 糖基化蛋白质组学研究
• 1.3.3 蛋白质定量
• 1.3.3.1 基于一维胶和二维胶的定量
• 1.3.3.2 Label-free定量
• 1.3.3.3 化学标记定量
• 1.3.3.4 稳定同位素代谢标记定量
• 2. 病毒蛋白质组学概述
• 2.1 病毒粒子的蛋白质组学研究
• 2.1.1 DNA病毒
• 2.1.1.1 疱疹病毒
• 2.1.1.2 白斑综合症病毒
• 2.1.1.3 其他DNA病毒
• 2.1.2 RNA病毒
• 2.2 病毒的蛋白相互作用组学
• 2.1.1 酵母双杂交
• 2.1.2 亲和纯化
• 2.1.3 免疫沉淀
• 2.3 病毒引起的宿主差异蛋白组学
• 2.3.1 流感病毒
• 2.3.2 登革病毒
• 2.3.3 乙型肝炎病毒
• 2.3.4 SARS冠状病毒
• 第二章 HearNPV两种病毒粒子的比较蛋白质组学研究
• 1. 引言
• 2 材料与方法
• 2.1 细胞培养和病毒纯化
• 2.2 ODV和BV核衣壳和囊膜组分分离
• 2.3 SDS-PAGE电泳和胶内酶解
• 2.4 溶液内酶解
• 2.5 C18柱脱盐
• 2.6 iTRAQ标记
• 2.7 HILIC色谱分离
• 2.8 SCX色谱分离
• 2.9 Ziptip C18脱盐
• 2.10 IMAC富集磷酸化肽段
• 2.11 SPEG富集N-糖基化肽段
• 2.12 LC-MS/MS分析
• 2.13 质谱数据分析
• 2.14 磷酸化位点确定性分析
• 2.15 数据的统计学分析
• 2.16 蛋白免疫印迹
• 3 实验结果
• 3.1 SDS-PAGE分离蛋白何胶内酶解质谱分析
• 3.2 “鸟枪法”分析BV,ODV蛋白
• 3.3 iTRAQ方法对病毒蛋白的亚细胞定位
• 3.4 蛋白免疫印迹对病毒蛋白的亚细胞定位
• 3.5 病毒粒子的翻译后修饰蛋白质组学研究
• 3.6 病毒粒子相关的宿主蛋白
• 4. 讨论
• 4.1 病毒粒子蛋白组成
• 4.2 病毒粒子蛋白的翻译后修饰
• 4.3 和病毒相关的宿主蛋白
• 4.4 本研究所使用的方法对其他病毒蛋白质组学研究的意义
• 5. 小结
• 第三章 日本乙型脑炎病毒入侵HeLa细胞的定量蛋白质组学分析
• 1. 前言
• 2. 实验方法和材料
• 2.1 病毒和细胞培养
• 2.2 SILAC培养基配制及细胞培养
• 2.3 病毒感染细胞
• 2.4 核质分离
• 2.5 溶液内酶解和C18脱盐
• 2.6 SCX分离肽段和Ziptip C18脱盐
• 2.7 LC-MS/MS分析样品
• 2.8 蛋白质鉴定
• 2.9 蛋白质定量
• 2.10 Gene Ontology分析
• 2.11 STRING分析和Cytoscape作图
• 2.12 蛋白免疫印迹
• 2.13 免疫荧光
• 2.14 细胞RNA的提取
• 2.15 反转录
• 2.16 PCR和琼脂糖电泳
• 2.17 qRT-PCR
• 2.18 RNA转染
• 2.19 RNA和DNA共转染
• 2.20 双荧光素酶报告基因测定
• 2.21 空斑实验
• 3. 实验结果
• 3.1 JEV在HeLa细胞中的活性检测
• 3.2 定量蛋白质组学分析
• 3.3 蛋白免疫印迹验证质谱数据
• 3.4 免疫荧光检测变化蛋白
• 3.5 Gene Ontology分析
• 3.6 STRING分析
• 3.7 显著变化蛋白对JEV复制的影响
• 3.8 IFITM3,RANBP2,SAMD9和VAMP8功能的探索
• 4. 讨论
• 5. 小结
• 第四章 总结与展望
• 引用文献
• 附表
• 英文缩写对照表
• 攻博期间发表的科研成果
• 致谢