青岛文昌鱼TIP30基因的克隆、表达与进化分析

论文摘要

TIP30,又称CC3,是一个在人体各组织广泛表达的保守基因,被认为是一个抑癌基因,又可特异性地提高HIV-1增殖调节蛋白Tat的转录。文昌鱼（Amphioxus）是介于无脊椎动物和脊椎动物之间的过渡类型,是研究脊椎动物进化的珍贵材料。利用分子生物学手段和生物信息学方法,研究文昌鱼TIP30基因的结构、表达和进化,可以揭示文昌鱼TIP30基因与无脊椎动物和脊椎动物TIP30基因之间的相互关系,有助于我们从分子水平上来了解脊椎动物的起源与进化。本文对TIP30基因的克隆、表达及进化方面进行了研究。首先利用RT-PCR和RACE等方法克隆了青岛文昌鱼TIP30基因,AmphiTIP30。AmphiTIP30的全长cDNA序列为1499bp,包含一个822 bp的开放阅读框（ORF）,在5’端有两个起始密码子（ATG）:第一个ATG编码一个23个氨基酸组成的信号肽;第二个ATG所编码的蛋白质为成熟蛋白,由237个氨基酸组成,其分子量大约为26 KDa。该蛋白在氨基酸水平上与菌类的相似性为21.3–28.7%,与无脊椎动物的相似性为17.3-41.3%,与硬骨鱼的相似性为53.2%,与两栖类的相似性为49.8%,与哺乳动物的相似性为50.6-51.9%,且具有TIP30的特征基序:ATP结合基序（GXXGXXG）和一个典型的TIP30保守结构,在相同的位置含有人等TIP30蛋白共有的3个典型的氨基酸残基（Ser166, Tyr177 and Lys181,序号为人TIP30）。在所构建的进化树中,文昌鱼的TIP30蛋白位于脊椎动物分枝的基部,脊椎动物和无脊椎动物各自聚群,支持了在系统进化上文昌鱼是脊椎动物起源动物的观点,也进一步证明AmphiTIP30是脊椎动物和无脊椎动物TIP30蛋白的同源物。Northern杂交和切片原位杂交表明,TIP30基因在文昌鱼中主要表达于卵巢组织利用原核表达并纯化了文昌鱼TIP30蛋白,获得了分子量约为29KDa的纯化蛋白。生化试验证明其对NADPH具有较大的结合常数,并具有还原酶活性;使用成品TIP30多克隆抗体进行Western杂交结果表明,抗体能与我们的纯化蛋白AmphiTIP30特异性杂交。另外,免疫组化结果表明,TIP30在文昌鱼主要分布在卵巢组织,与切片原位结果一致,这似乎预示着TIP30与卵巢的发育有关联。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1. 文昌鱼
• 1.1 种类及分布
• 1.2 生活习性
• 1.3 形态结构
• 2. 文昌鱼分子生物学研究
• 2.1 文昌鱼在基因倍增研究中的重要作用
• 2.2 文昌鱼比较基因组学中的重要作用
• 2.3 文昌鱼基因家族的系统进化分析
• 2.4 文昌鱼与分子发育生物学
• 3. TIP30/CC3 的研究进展
• 3.1 TIP30/CC3 的发现
• 3.2 TIP30/CC3 的结构特征
• 3.3 TIP30/CC3 的生理功能
• 3.4 TIP30/CC3 研究展望
• 4. 本论文的主要内容和技术路线
• 第二章 青岛文昌鱼TIP30基因的克隆及进化分析
• 1. 前言
• 2. 材料和方法
• 2.1 材料
• 2.2 方法
• 2.2.1 总RNA 的制备
• 2.2.2 文昌鱼TIP30 基因保守片段的扩增
• 2.2.3 RACE 技术扩增TIP30 基因cDNA 全长
• 2.2.4 Northern 杂交
• 2.2.5 切片原位分析TIP30 基因在成体文昌鱼组织中的表达
• 2.2.6 文昌鱼TIP30 基因组DNA 的PCR 扩增和测序
• 2.2.7 序列比较与系统进化分析
• 2.2.8 AmphiTIP30 的空间结构分析
• 3. 结果
• 3.1 文昌鱼总RNA的提取
• 3.2 文昌鱼TIP30 基因cDNA 的克隆
• 3.3 总RNA 的Northern 杂交和切片原位杂交
• 3.4 文昌鱼TIP30 基因的序列分析
• 3.5 文昌鱼TIP30 基因组DNA 的克隆和结构分析
• 3.6 AmphiTIP30 的立体结构分析
• 4. 讨论
• 第三章 青岛文昌鱼TIP30 蛋白的融合表达、纯化、鉴定及特性分析
• 1. 前言
• 2. 材料和方法
• 2.1 材料
• 2.2 方法
• 2.2.1 表达载体的构建
• 2.2.2 大肠杆菌DH-5α感受态细胞的制备
• 2.2.3 连接产物的转化
• 2.2.4 挑阳性克隆并提取其质粒做酶切及PCR 检测
• 2.2.5 重组质粒Pet-28-TIP30 的序列测定
• 2.2.6 含pET-28-TIP30 的表达载体的大肠杆菌DH-5α中的诱导表达
• 2.2.7 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 2.2.8 含pET-28-TIP30 的表达载体的大肠杆菌DH-5α中表达条件的优化
• 2.2.9 重组His-TIP30 融合蛋白的纯化
• +（NADPH）结合系数的测定'>2.2.10 重组His-TIP30 融合蛋白与NADP⁺（NADPH）结合系数的测定
• 2.2.11 重组His-TIP30 融合蛋白还原酶活性的测定
• 2.2.12 重组His-TIP30 融合蛋白的Western blot 检测
• 2.2.13 文昌鱼TIP30蛋白的免疫组织化学检测
• 3 结果
• 3.1 TIP30基因的PCR扩增
• 3.2 pET-28-TIP30表达载体的构建
• 3.3 重组pET-28-TIP30在大肠杆菌中的表达及表达条件的优化
• 3.4 重组His-TIP30融合蛋白的纯化
• +（NADPH）结合系数的测定'>3.5 重组His-TIP30 融合蛋白与NADP⁺（NADPH）结合系数的测定
• 3.6 重组His-TIP30 融合蛋白酶活测定
• 3.7 TIP30 蛋白的Western blot 检测
• 3.8 文昌鱼TIP30 蛋白的免疫组织化学分析
• 4 讨论
• 总结与展望
• 参考文献
• 附录
• 致谢