一、全自动特种蛋白免疫分析仪缓冲液、稀释液的研制（论文文献综述）
张婷[1]（2021）在《转基因兔乳汁中重组吸血蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂的纯化、结构分析和药效研究》文中提出近年来,血栓性疾病越发受到关注,临床上有逐年渐增之势,严重威胁人类的生命健康。用溶栓药消除血栓是一种临床常用的方法。现有的溶栓药虽然有明确的治疗效果,但也存在治疗窗口期窄,用药量大,纤维蛋白特异性低,再灌注率低,系统出血率高,半衰期短,副作用大等问题。而纤维蛋白特异性高,溶栓效率高,出血风险低,半衰期长,毒副作用低的吸血蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂（Desmodus rotundus salivary plasminogen activator alpha 1,DSPAα1）又称去氨普酶（desmoteplase）,有望成为新型、高效的溶栓药物。本研究应用哺乳动物转基因技术,在获得了乳腺特异性表达重组DSPA（recombinant DSPA,rDSPA）转基因兔的基础上,收集兔乳中的表达产物,应用自制的单克隆抗体,用于兔乳的ELISA和Western-blot检测;建立从转基因兔乳汁中分离和纯化rDSPA的方法;对rDSPA进行一级结构和生物活性分析,包括N端和C端氨基酸序列、相对分子量以及体外溶纤活性;应用角叉菜胶制备大鼠尾部血栓模型,并通过此血栓模型研究纯化产物rDSPA的体内溶栓效果及血浆半衰期。1.乳腺特异性表达rDSPA转基因兔的传代繁殖两只原代兔经扩群繁殖、近交和回交,获得乳腺特异性表达rDSPA转基因兔134只,其中经测交确定纯合子兔2只（F2代）。收集兔乳,离心分离乳清,经ELISA检测,兔乳中rDSPA表达水平为1.19±0.26 mg/mL,纤维平板溶圈法（Fibrin Agarose Plate Assay,FAPA）检测F0代、F1代、F2代转基因兔乳清中DSPA的溶纤活性,溶圈直径大小基本一致（18.6-20.4 mm）,结果表明外源基因rDSPA能稳定遗传给后代,此外培育出的纯合子兔能免除繁琐的基因型检测工作量,为rDSPA的转基因兔的保种提供了保障。2.原核表达去氨普酶（DSPA）基因载体的构建采用分子生物学技术,用PCR法扩增pCL25/DSPA表达载体上的编码DSPAαl成熟肽的DNA序列,用于与原核表达载体连接,构建pET-28a/DSPA原核表达载体。pET-28a/DSPA原核表达载体转入Rosetta感受态细胞,进行诱导表达目的蛋白。SDS-PAGE电泳估测大小约为50 kDa。目的蛋白纯化后纯度为92%,远远满足其作为制备rDSPA单克隆抗体的免疫原的纯度要求。3.rDSPA单克隆抗体制备及筛选纯化的原核表达产物加弗氏佐剂免疫BALB/c小鼠,分离B淋巴细胞与SP2/0细胞融合,筛选获得阳性杂交瘤细胞株,分泌PR-mAb杂交瘤细胞注入同系小鼠腹腔制备抗体。本研究共得到36株阳性杂交瘤细胞,从中筛选出12株稳定分泌抗体的细胞株（命名M1-M12）。经ELISA-elution筛选,其中M3、M4两株为多羟基反应单克隆抗体（PR-mAb）,筛选率为16.67%（2/12）。注射M3和M4细胞株的小鼠腹水的抗体效价为1:125000,腹水抗体可用于ELISA和western blot检测。4.转基因兔乳中rDSPA的分离、纯化小鼠腹水抗体经rProtein A亲和层析柱纯化后与CNBr-activated Bestarose 4 FF介质偶联制成免疫亲和层析柱。rDSPA转基因兔乳经超速离心和硫酸铵沉淀预处理后。分别选用自制免疫亲和层析、苯甲醚亲和层析、阳离子交换层析、赖氨酸亲和层析和活性蓝亲和层析纯化rDSPA。结果表明rDSPA转基因兔乳通过超速离心、55%硫酸铵沉淀、苯甲醚亲和层析、阳离子交换层析、赖氨酸亲和层析和活性蓝亲和层析分离纯化,获得纯度为98%的rDSPA。运用阴离子交换层析去除纯化产物中的内毒素,使用内毒素检测试剂盒检测结果表明纯化rDSPA内毒素含量低于0.015 EU/mL,符合注射剂标准。5.乳腺特异性表达rDSPA纯化产物的结构和功能检测运用Edman降解法测定rDSPA的N端氨基酸序列,结果显示rDSPA的N端氨基酸序列为 Val Ala Cys Lys Asp Glu IIe Thr Gln Met Thr Tyr Arg Arg Gln,与设计的 DSPA编码序列的理论N端的第4-18位氨基酸序列完全一致,表明rDSPA编码序列N-端的山羊β-乳球蛋白（β-lactoglobulin）的信号肽已完全切除;运用液相色谱-质谱/质谱联用技术（LC-MS/MS）测定rDSPA的C端氨基酸序列及其它部分的氨基酸序列,结果显示 rDSPA 的 C 端氨基酸序列为 Asp Val Pro Gly Val Tyr Thr Lys Tyr Leu Gly Trp IIe Arg Asp Asn Met His Leu,与设计的rDSPA编码序列的C末端完全一致,共有47%（208个氨基酸）的序列与DSPA编码序列完全同源。经高分辨率质谱仪检测后确定rDSPA的相对分子量为53126.75 Da,大于理论的49535.94 Da,推测是翻译后的糖基化修饰导致;运用纤维平板溶圈法（FAPA）检测纯化产物rDSPA的体外纤溶活性（773333 IU/mg）略高于阿替普酶（580000 IU/mg）。6.rDSPA体内外溶栓效果的初步评价SD大鼠腹主动脉采血,血凝块切成约0.1 cm3方块并称重,分成7组（0.5 μg/mL、1 μg/mL、2 μg/mL DSPA;0.5 μg/mL、1 μg/mL、2 μg/mL 阿替普酶;生理盐水）,37℃孵育16 h,称重剩余血凝块并计算血凝块溶解率。结果显示rDSPA体外大鼠血凝块溶解率（48.34±2.25%）明显高于阿替普酶组（40.91±1.36%）的血凝块溶解率（p<0.05）,表明rDSPA体外溶栓活性强于阿替普酶。8周龄的雄性SD大鼠随机分成4组,每组6只,分成低、中、高剂量rDSPA组（2 mg/kg、8 mg/kg、32mg/kg）和阿替普酶组（8 mg/kg）,安慰剂组,空白对照组。各组大鼠心脏采血检测凝血活酶时间（APTT）、凝血酶原时间（PT）、凝血酶时间（TT）,纤维蛋白原（FIB）和D-二聚体,同时测量大鼠尾部血栓长度。结果显示rDSPA有显着的溶栓效果,rDSPA低（APTT:18.80±1.26 s;TT:35.75±0.41 s）、中（APTT:27.78±1.88 s;TT:39.18±0.82 s）、高（APTT:36.51±1.29 s;TT:37.56±1.07 s）剂量组和阿替普酶组（APTT:27.00±1.76 s;TT:34.05±0.99 s）的 APTT、TT 均较安慰剂组（APTT:12.53±0.54 s;TT:26.87±1.31 s）相比有所延长,且差异极显着（p<0.01）,rDSPA 中（PT:14.28±0.79 s;D-二聚体:2.49±0.07 mg/L）、高（PT:17.07±1.19 s;D-二聚体:3.12±0.55 mg/L）剂量组和阿替普酶组（PT:14.26±0.93 s;D-二聚体:2.53±0.12 mg/L）的PT、D-二聚体水平均比安慰剂组（PT:12.29±0.76 s;D-二聚体:2.30±0.07 mg/L）显着升高（p<0.05）,表明大鼠注射rDSPA和阿替普酶后都有效激活纤溶系统。阿替普酶组（200.22±6.09mg/dL）较rDSPA低（222.40±7.89 mg/dL）、中（228.30±1.72mg/dL）、高（228.19±1.89mg/dL）剂量组的 FIB 水平较有所下降（p<0.05）,rDSPA低、中、高剂量组之间的FIB水平差异不显着,表明rDSPA在溶栓过程中FIB消耗量小于阿替普酶,相比阿替普酶不易引起颅内出血副作用,更具有安全性。rDSPA低（48.96±9.42%）、中（24.71±6.26%）、高（0.00±0.00%）剂量组和阿替普酶组（49.19±6.21%）的大鼠尾栓相对长度百分比明显小于安慰剂组（67.76±6.06%）,即rDSPA低、中、高剂量组的尾栓消溶相对长度明显长于安慰剂组,并与剂量成正比例,且rDSPA高剂量组大鼠尾部不形成血栓。相同剂量的rDSPA中剂量组（24.71±6.26%）和阿替普酶组（49.19±6.21%）的大鼠尾栓相对长度百分比差异极显着（p<0.01）,表明纯化产物rDSPA的溶栓能力明显优于阿替普酶。8周龄的SD雄性大鼠随机分成2组,每组4只,分为rDSPA组和阿替普酶组。rDSPA组和阿替普酶组均以8 mg/kg的剂量尾静脉注射rDSPA或阿替普酶,采集血浆进行纤溶酶-抗纤溶酶复合物（PAP）的测定,计算rDSPA半衰期。结果显示rDSPA组和阿替普酶组大鼠血浆PAP浓度分别在6 min及3 min达到顶峰（133.06±63.90 ng/mL,219.44±1.18 ng/mL）,rDSPA和阿替普酶在SD大鼠体内的血浆半衰期分别为52.41 min和10.41 min。推算rDSPA的半衰期较阿替普酶延长5倍,表明rDSPA可用于单次注射针剂溶栓药的制备。综上所述,本研究成功培育出乳腺特异性表达rDSPA转基因兔,且rDSPA转基因兔具有较高的表达水平,建立了有效的分离纯化的实验室工艺,并保持原有的溶纤溶栓活性,表明该研究迈出临床应用的第一步。rDSPA的一级结构分析表明,重组DSPA编码序列可以在转基因兔乳腺上皮细胞中表达,并剪切去除异源性的信号肽序列,翻译后加工为有溶栓活性的成熟蛋白,这一结果在国内外尚未见报道。大鼠体内外溶栓试验中rDSPA表现出优于阿替普酶的溶栓性能,且rDSPA在大鼠体内的半衰期长于阿替普酶,体内溶栓试验呈现出更安全、更持续的溶栓效果,该结果在国内外也未见报道。本研究成果为开发和生产新的高效溶栓药奠定了实验基础。
郭江华[2]（2021）在《用于检测抗环瓜氨酸肽抗体的胶乳增强免疫比浊试剂的制备、表征及评价》文中研究表明目的:类风湿关节炎（rheumatoid arthritis,RA）是具有自身自体免疫特性的疾病,通过侵蚀人体关节滑膜,从而引起关节疼痛和损坏,严重可能会造成关节畸形,出现残疾等后果。目前为止,只有类风湿因子（rheumatoid factor,RF）与抗环瓜氨酸肽抗体被欧洲风湿病学联盟以及美国风湿病学会在2010年正式纳入RA血清的诊断标准中,RF虽然作为血清检测诊断检查指标和检测标准,但是在系统性型红斑狼疮发热综合征、干燥综合征患者中也很容易被检测到,并且与抗环瓜氨酸肽抗体相比,RF的特异性和灵敏度都低很多。目前,商业化的抗环瓜氨酸肽抗体的检测产品主要是采用酶联免疫法和化学发光法,这两种方法人为因素干扰较大、检测周期长、且试剂盒的技术核心主要被国外巨头诊断公司垄断,诊断检测成本高,容易被卡脖子。本项目旨在运用胶乳增强免疫比浊法原理,研发一种灵敏度高、特异度高、检测成本低、检测周期短的抗环瓜氨酸肽抗体诊断试剂盒。方法:（1）根据人体丝状蛋白的序列,对环瓜氨酸肽的氨基酸序列通过替换、删除或增加氨基酸三种形式进行设计,利用间接酶联免疫法,筛选与类风湿关节炎病患血清有特异性反应序列的环肽;（2）筛选出来的环肽与微球进行偶联,探索偶联过程的反应条件和相关参数,主要优化微球的粒径、环肽的用量及种类、活化剂EDC的用量、偶联pH、微球的含量、检测波长;（3）通过透射电子显微镜、动态光衍射扫描仪以及Zeta电位来观察胶乳微球、偶联之后的胶乳以及与抗体反应之后的胶乳试剂的微观形貌分布以及粒径检测;（4）对制备好的胶乳试剂性能按照临床诊断要求进行评价,包括胶乳试剂的标准曲线、空白吸光度值、线性范围、准确度、精密度、灵敏度以及自制胶乳试剂与ELISA试剂盒对抗环瓜氨酸肽抗体检测的相关性。结果:（1）环瓜氨酸肽的筛选:优化RA患者血清的稀释倍数为50倍,有明显特异性反应的环肽为CCP1、CCP7、CCP9、CCP11、CCP12;（2）环肽与微球偶联的最优条件:0.2mg的CCP1与0.2%的P0118微球进行偶联,1%EDC的用量为60μL、偶联缓冲体系为pH 6.0 MES缓冲液、检测波长600 nm。（3）透射电镜扫描结果显示环肽成功地与微球偶联在一起,分散性能好;动态光衍射扫描结果进一步验证了偶联反应以及免疫反应的良好性能,胶乳的Zeta电位从胶体电荷角度证明了胶乳的稳定性。（4）对制备的胶乳试剂性能的评价发现,制备的胶乳达到临床检测要求。
韩霜[3]（2021）在《骨代谢生物标志物定量免疫分析技术的研究》文中研究指明骨质疏松患者在全球范围内约有2亿人,在常见病、多发病中位居第七。根据WHO的调查显示,骨质疏松症将是继心血管疾病后第二大医疗问题。骨质疏松症的诊断和预后监测,目前主要以骨密度（BMD）检测为诊断标准。骨密度只能静态的反应骨的形态,但是骨量的变化无法检测。鉴于骨代谢的动态监控一直以来缺乏精准特异的生物学标志物,骨代谢生物标志物是近十年来的一个研究热点。最近已发现有明确意义的骨代谢标志物有:骨钙素（BGP）、甲状旁腺激素（PTH）、总Ⅰ型胶原氨基端延长肽（P1NP）、25-羟基维生素D（25-OH VD）。这些标志物可从完整的骨组织水平精确地评价骨转换效率,从而实现骨质疏松在临床上的定量辅助诊断。但是如何实现这些生物标志物的临床检测以及标志物与疾病的临床价值仍是一个难点,主要原因是骨代谢标志物的抗体获取困难,以及检测方法学的不成熟。在中国,由于上述技术难点,导致国内外能够生产供应骨代谢检测试剂项目的企业只有瑞士的罗氏诊断公司。这对我国有明确价值的骨代谢标志物的推广有极大的限制,对于广大患者经济上是一个很大的负担,无法惠及广大患者。本论文针对骨代谢生物原材料获取困难,采用多肽免疫得到一对P1NP单克隆抗体,同时利用大肠杆菌表达体系成功表达出P1NPα1链,从肿瘤病人的胸积液中纯化出天然的P1NP蛋白;利用VD3成功免疫得到高特异性和亲和力的维生素D抗体。依托化学发光免疫分析技术平台,开发了骨代谢标志物化学发光免疫检测试剂,并测试了临床样本,和罗氏检测的结果比对相关性高。同时还收集了大量不同诊断患者的样本,测试骨钙素和25-羟基维生素D两个指标。通过对数据分析,能够对临床诊断和治疗产生一定的指导意义。针对肺移植病人术前和术后,测定了骨代谢标志物的指标,研究发现相对于传统的骨密度检测,骨代谢标志物能更好的监控骨量在一定阶段内的动态变化,对肺移植病人术后骨质疏松的诊断和治疗有着重大的意义。本论文主要研究内容为以下几个部分:（1）建立骨代谢标志物临床检测方法需用的关键生物原材料制备技术通过构建大肠杆菌的P1NP表达系统,表达P1NP蛋白的α1链,用于后续的抗体筛选。成功从人的胸积液中分离纯化天然的P1NP蛋白,用于抗体的筛选和校准品的制备。通过设计三条不同的α1链短肽免疫小鼠,筛选得到的P1NP单克隆抗体用于下一步试剂的开发。维生素D抗体的开发采用类似的方法,用VD3抗原去免疫小鼠,筛选纯化得到的维生素D单克隆抗体用于临床检测方法学的研究。（2）建立了骨代谢标志物全自动化学发光检测方法分别建立骨钙素（BGP）、甲状旁腺激素（PTH）、总Ⅰ型胶原氨基端延长肽（P1NP）、25-羟基维生素D（25-OH VD）化学发光检测方法。BGP试剂的精密度均小于10%,回收率在100%±10%的范围内,通过加速测试7 d,发光值的降低水平在10%的范围内。骨钙素试剂与罗氏试剂的方法学比对,相关系数R2为0.98,和罗氏结果的相关性非常好。当样本骨钙素的含量高达4000 ng·m L-1时,未发现钩状效应存在。P1NP试剂线性因子r大于0.99,最低检测限为3.11 ng·m L-1。三批P1NP试剂的批间和批内精密度CV均低于10%。当样本中P1NP的浓度大于4000 ng·m L-1时,未发现钩状效应存在。同罗氏P1NP试剂的方法学比对结果显示,相关系数R2为0.98,一致性很好。25-OH VD试剂批间和批内的精密度均小于10%,回收率在100%±10%范围内。加速稳定性发光值的降低在10%以内。将开发的试剂分别于罗氏和Dia Sorin检测的样本进行结果比对,与罗氏比对的相关系数R2为0.9;与Dia Sorin比对的相关系数R2为0.93,相关性高。同时将罗氏,Dia Sorin与本研究建立的方法与金标准液相质谱进行比对,罗氏与液相质谱比对的斜率为1.1,相关系数R2为0.80,Dia Sorin与液相质谱比对的斜率为0.8,相关系数R2为0.79,研究建立的方法与液相质谱比对的斜率为0.79,相关系数R2为0.90。综合结果来看,本研究建立的检测方法已超越了两个国外的产品。PTH试剂的最低检测限为0.2 pg·m L-1,线性因子r大于0.99,三个不同浓度样本的精密度均小于10%,通过与罗氏PTH试剂的方法学比对,斜率为0.99,相关系数R2为0.96,与罗氏的结果一致性很高。（3）研究了骨代谢标志物与临床疾病的关系研究了骨钙素和25-羟基维生素D与临床各种疾病的关系。女性高骨钙素含量的人群多为肥胖（24%）和肿瘤（51%）;而男性高骨钙素含量的人群分布更多的是在肿瘤（56%）和心脑血管疾病（32%）。研究发现测试25-羟基维生素D的患者中,94.98%的患者25-羟基维生素D的浓度低于30 ng·m L-1（参考值为30 ng·m L-1）。这些低维生素D含量的人群中,50%的病人为肥胖症患者;约20%为癌症患者;14%为骨折患者。通过对不同人群的25-羟基维生素D含量的分布统计,结果显示人体内25-羟基维生素D的含量可能与肿瘤、糖尿病、心脑血管疾病和骨关节炎这些疾病有密切的关系。本研究还首次建立了P1NP男性参考值区间。首次研究了骨代谢标志物和肺移植的关系。用本项目开发的骨代谢检测试剂定期追踪并检测肺移植患者术前和术后骨代谢标志物含量的变化。结果表明,在短时间的骨量监控上,骨代谢标志物能够更好的提示骨量的变化,而传统的骨密度检测要滞后于骨代谢标志物,这对于临床的诊断治疗有着非常大的意义。
吴泽[4]（2021）在《基于智能手机的免疫传感方法的研究及其在体外诊断中的应用》文中认为背景随着生活水平的提升,人们越来越关注自身的健康问题,对体外诊断技术尤其是可在现场使用的快速诊断技术的需求也越来越旺盛。近年来,归功于日益强大的功能及越来越高的普及度,智能手机已在体外诊断领域得到了广泛应用。目的研发新型的基于智能手机的免疫传感诊断系统,并应用于临床验证。方法制作两种基于智能手机的便携式免疫传感检测平台:（1）设计研制基于智能手机的酶联免疫层析传感器（ELICS）,对传感系统的制作工艺以及检测流程进行优化,并对癌胚抗原（CEA）进行检测验证,以判断其在临床诊断中的应用可行性。（2）设计研制基于智能手机的高通量光纤免疫传感器（HFIS）,并设计了配套的手机应用程序,对组成结构的制作组装过程进行了优化,并论证了它们的可行性和稳定性,然后整合系统应用于SARS-CoV-2结合抗体（IgG）和核衣壳蛋白（N蛋白）的检测分析。结果（1）成功建立了低成本可靠的基于智能手机的ELICS平台,该便携式传感系统由特殊设计的一次性免疫层析装置和结果阅读装置两个部分组成,在免疫层析装置上进行免疫测定和酶催化显色以形成生物传感通道,通过传感通道的透射光强度被智能手机上的环境光传感器直接读取。对于CEA的线性检测范围（LDR）为 0.031-1.95 ng/ml,检测限（LOD）为 0.016 ng/ml,并能实际用于临床样本的即时检测,检测结果与常规ELISA结果的相关性好（R2=0.999）。（2）成功建立了基于智能手机的可用于高通量检测的光纤免疫传感（HFIS）平台,该传感平台由基于径迹蚀刻膜（TE膜）的免疫学高通量检测板及基于光纤的微孔板阅读仪构成,利用TE膜的高效滤过及低吸附特性,配合免疫微球进行高通量快速免疫检测后酶催化底物显色,再利用光纤优秀的导光特性将透射光信号集中到一起,从而能利用手机近距离进行大规模信号捕捉,配合相应的APP进行结果数据处理及分析。对于SARS-CoV-2 IgG的临床样本检测结果与ELISA相关性好（R2=0.9362）,检出率更高,无需繁杂洗涤及孵育步骤;对于N蛋白标准品的检测LDR为7.8-1000pg/ml,LOD为7.5 pg/ml,比传统ELISA的检测灵敏度更高,线性范围更宽,检测结果与Simple western结果相关性好（R2=0.9781）。结论（1）提出的ELICS平台装置小巧,对于小批量样本能实现更快速和直接数字定量检测。（2）提出的HFIS平台检测灵敏度高,便携且操作简单,适合于批量样本快速痕量检测分析。研发的两种基于智能手机的免疫传感平台均能实现快速检测,且不依赖大型仪器,灵敏度高,制作及使用成本低,适用于现场检测。均具有很好的平台适用性,通过更换对应的抗体或配体,在临床诊断及初筛、个性医疗、环境监测、食品安全检测等领域都具有很好的应用前景。
孙光[5]（2020）在《ID-UPLC-MS/MS测定人血清总睾酮方法的建立及应用》文中研究表明目的建立一种用同位素稀释超高液相色谱串联质谱法（ID-UPLC-MS/MS）测定人血清总睾酮的方法,优化样品前处理条件和色谱质谱检测条件,为建立血清总睾酮的候选参考方法奠定基础。对同位素稀释超高液相色谱串联质谱法（ID-UPLC-MS/MS）测定人血清总睾酮的方法进行方法学性能评价,考察其是否具备作为候选参考方法的能力。应用建立的UPLC-MS/MS方法对市售免疫分析平台进行一致性比对,然后进行混合血清睾酮参考物质（工作校准品）的制备探索,为形成血清睾酮的完整参考体系和提供合理的量值溯源流程而努力。方法用同位素内标平衡血清,用酸性缓冲液处理以从结合蛋白中释放睾酮。通过两个连续的液液萃取步骤分离睾酮,第一次提取使用乙酸乙酯和正己烷从酸性缓冲溶液中分离脂质,将有机相吹干并在碱性缓冲溶液中重构;第二次提取通过正己烷除去其它极性脂质如磷脂。使用超高效液相色谱串联质谱法（UPLC-MS/MS）结合正离子模式电喷雾电离,在多反应监测模式下（MRM）测量人血清中总睾酮水平。对候选参考方法的方法学性能包括精密度、准确度、灵敏度、特异性、线性范围、基质效应、样品提取效率及样品存放稳定性进行了全面详细的分析评估。使用建立的候选参考方法进行一些应用探讨,首先,以UPLC-MS/MS的候选参考方法作为参比方法,以市售三种免疫分析平台为待测方法进行人血清总睾酮检测方法结果一致性的结果评估。其次,使用候选参考方法制备混合血清睾酮参考物质（工作校准品）,根据相关规定进行参考物质测量不确定度评估,主要包括定值不确定度、均匀性不确定度和稳定性不确定度三个部分,完善评估流程。结果建立的同位素稀释超高液相色谱串联质谱法（ID-UPLC-MS/MS）测定人血清总睾酮的方法日内和日间测定的变异系数（CV）分别为2.13%（1.40%-2.77%）、3.44%（3.06%-3.66%）。两个浓度样品的回收率为94.32%至108.60%。该方法的检出限LOD为0.50 ng/dL,定量限LOQ为1.00 ng/dL。线性范围为1-1000 ng/dL,扩展测量范围为1-10000 ng/dL。此外,三种不同浓度的质控血清的提取效率为85.02%至93.29%。测试睾酮的结构类似物（8种）,发现它们不会干扰睾酮的测定,30份血清样品的QI/CI比值均在校准品的平均QI/CI比值的±20%以内,表明该方法不受干扰物质的影响。基质效应对检测的影响也是非常小的。与UPLC-MS/MS方法相比,三种免疫分析方法的平均偏倚百分比男性3.24%低于女性11.63%。使用建立的候选参考方法给混血血清睾酮标准物质定值的结果 RM1 为 50.7±1.7,RM2 为 152.9±2.3,RM3 为 405.7±3.6,RM4为792.7±6.9,认定值的表达式为:标准值（ng/dL）±扩展不确定度（ng/dL,U）,扩展因子取值k=2。结论同位素稀释色谱串联质谱检测人血清睾酮的方法具有出色的准确度和精密度,特异性高、线性范围广和基质效应影响小,特别是在低值区间内表现良好,可以作为临床人血清睾酮检测的常规方法,具有建立溯源参考系统中的参考方法的潜力。通过建立的UPLC-MS/MS方法与免疫分析平台的一致性比较,可以看到一些方法显示出可接受的性能,一些方法还需要改善,特别是在较低的睾酮浓度下问题更加明显。用建立的UPLC-MS/MS方法制备的混合血清睾酮参考物质（工作校准品）,体现出同位素稀释质谱法的作为国际推荐参考方法的性能优势,得到的参考物质均匀性、稳定性良好,定值准确可靠。从实验结果看,基本已经形成了整套围绕候选参考方法进行参考物质制备、不确定度评估的标准化流程,进而形成了参考实验室、参考方法和参考物质组成的参考系统的雏形。
朱红[6]（2020）在《固相时间分辨免疫荧光层析检测LH方法的建立与评价》文中指出目前,促黄体生成素（LH）的检测主要分为定性检测和定量检测。定性检测多采用胶体金免疫层析法,肉眼即可判读,操作简单,但灵敏度低只适用于初筛。定量检测有主要有放射免疫检测法、酶联免疫吸附法、化学发光免疫法、时间分辨荧光免疫分析技术等。其中,放射免疫检测法存在放射性核素污染、标记物的货架期短等问题,临床上使用频率低。酶联免疫吸附法耗时长、操作复杂,且酶的大分子标记容易影响被标记物的空间结构,限制了检测的灵敏度。化学发光法是目前临床上应用比较多的检测方法,其灵敏度高,特异性好,但耗时长,对检测仪器有较高的要求。时间分辨荧光免疫分析技术与其他定量检测方法相比,无污染、灵敏度高且对设备没有太高要求,但以微孔板为反应载体,需要洗涤分离结合标记与游离标记,操作过程步骤多、周期长、样品消耗大、不易自动化,难以广泛应用于生物医学研究和临床医学检验。本论文结合时间分辨荧光免疫分析技术和层析技术的优点,采用双抗体夹心法,将偶联时间分辨荧光微球后的抗体固化在玻纤上,建立一种新型的固相时间分辨免疫层析法,并用于定量检测促黄体生成素（LH）。相对于传统的液相时间分辨免疫层析法（即偶联时间分辨荧光微球后的抗体保存于样本稀释液中）,该法灵敏度更高,读数时间更短、与高浓度同源性激素临床样本交叉反应更低,且试剂的稳定性更好,保存期限长,成本低廉,结果准确、检测便捷。经多轮实际试用,已证明其适合大规模临床应用。方法将LH单克隆抗体（检测抗体）和羊抗鸡IgY（质控抗体）标记铕离子荧光微球后处理在结合垫上;另一株LH单克隆抗体（包被抗体）包被于硝酸纤维素膜的检测线T位置;鸡IgY抗体包被在硝酸纤维素膜质控线C位置,将包被好的底片材料、荧光结合垫和样品垫组装成免疫层析试剂条,建立时间分辨荧光免疫层析方法。血清中的LH与标记了 Eu-CM的LH检测抗体特异性结合,形成抗原抗体反应复合物,该反应复合物沿着硝酸纤维素膜前移,在硝酸纤维素膜T位置形成包被抗体-LH-检测抗体-Eu-CM复合物,在C线位置形成鸡IgY-山羊抗鸡IgY-Eu-CM复合物,使用免疫荧光检测仪检测T、C位置的荧光信号并计算比值（T/C）,通过标准曲线计算得出LH血清样本的浓度。从LH抗体的性能、荧光结合垫处理溶液配方及工艺、样品垫的配方及抗体包被配方等几个方面进行研究和优化。在最佳的实验条件下,通过最低检出限、线性范围、精密度、准确度、特异性、稳定性等方面对所建方法进行性能评价。收集常规检测LH可信度较高的化学发光法（CLIA）检测标本后,再用所建方法重复检测,验证方法的可靠性。结果本研究建立了一种基于时间分辨荧光免疫分析技术和层析技术相结合的促黄体生成素（LH）免疫层析检测方法并制成试剂盒,该方法检测促黄体生成素（LH）的最低检出限为0.165mIU/mL,检测范围0.5-200mIU/mL,与同源高浓度性激素人绒毛膜促性腺激素（HCG）、促卵泡激素（FSH）、促甲状腺素（TSH）无交叉反应,稳定性好,常温下可保存2年。同雅培全自动化学发光分析系统相比,两种检测方法间的线性相关系数为0.9874（n=120）,两种方法学具有高度的相关性。而本方法检测时间更短,仅需15分钟（化学发光法要30分钟）,采用的荧光免疫分析仪体积更小,成本更低,使用更为简便、广泛。临床试用结果已证明其在灵敏度,读数时间、特异性、保存期限等方面拥有较大大的优势,且成本低廉,结果准确、检测便捷,已有商品化试生产。综上所述,本研究为临床检测血清中促黄体生成素（LH）提供一种快速、准确的免疫层析检测方法并制成试剂盒,各项指标（灵敏度、精密度、特异性、稳定性、准确性）均达到临床检测要求。为其他激素的临床检测提供了一种新的检测方法,具有较为广阔的应用前景。
黄德智[7]（2019）在《细菌感染标志物快速定量检测方法的建立及初步应用》文中研究说明背景脓毒症是机体对于感染的失控反应所导致的威胁生命的器官功能障碍,全球每年脓毒症患病人数超过1900万,其中有600万患者死亡,病死率超过1/4,存活的患者中约有300万人存在认知功能障碍。造成如此高的病死率就是由于脓毒症以误诊、漏诊,所以能及时准确检测细菌感染标志物可以辅助诊治脓毒症,降低病死率。其中降钙素原（procalcitonin,PCT）和白介素6（interleukin 6,IL-6）作为细菌感染标志物已广为认可,它们均与细菌感染严重程度呈正相关,PCT在判断细菌和非细菌性感染时较为特异,IL-6动态监测利于判断诊治效果和预后。健康人群中PCT和IL-6的浓度分别为小于0.05ng/mL和约为6 pg/mL,而在严重细菌感染发生时,又可以分别可高达100 ng/mL和1000pg/mL。现行的检测方法以酶联免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）和化学发光法（chemiluminescent immunoassay,CLIA）为主,ELISA操作复杂、耗时长、步骤多、价格昂贵、批量操作,中间过程受影响因素较多,CLIA操作均相对复杂、耗时较长、需要大型专业的设备、价格稍贵。现在政府和卫健委正大力推进分级诊疗和发展社区门诊等基层医疗机构,而基层医疗机构对感染疾病的诊治往往依靠经验,易造成脓毒症的误诊、漏诊和抗生素滥用,所以需要与之相适应的PCT和IL-6检测方法,ELISA和CLIA对于这样的基层医疗机构来讲适用性不强。所以现在需要一种快速简便、易操作和利于基层医疗机构推广的方法检测PCT和IL-6,有助于临床及时有效地诊治脓毒症。免疫层析技术（immunochromatography assay,ICA）是也称作侧向免疫分析法（lateral flow assay,LFIA）,是一种结合薄层色谱技术和免疫识别反应的固相免疫分析法,为即时检测（point of care testing,POCT）提供了一个很好的平台,具有快速、简便、易操作等优点,广泛应用于金属离子、核酸、蛋白质和细菌等物质的检测。免疫层析技术的核心就是标记物,应用到免疫层析的标记物有胶体金、碳纳米材料、上转换发光纳米微球（up-converting phosphor nanoparticles,UCP）、量子点（quantum dots,QDs）、铕纳米微球（europium nanoparticles,Eu-np）和磁性纳米材料等,而其中Eu-np有着独特的光学性质:荧光寿命长,良好的光稳定性,stokes位移大（超过150nm）,激发光谱和发射光谱无交叉,特征峰非常尖锐,标记物体积小,标记物不会影响被标记物（尤其对蛋白质的影响小）的空间立体结构,保证了被标记物物化性质的稳定性。由于Eu-np独特的光学性质,可很大程度降低非特异性荧光信号而获得高灵敏度。通过检测/质控（T/C）比值可以对PCT和IL-6进行定量检测。目的本研究根据时间分辨技术和免疫层析技术的原理,以试纸条为载体,运用便携式免疫荧光分析仪为检测平台,研制可快速、简便、定量检测PCT和IL-6的时间分辨免疫层析试纸条,为基层医疗机构可以快速准确诊断脓毒症奠定了基础。方法1.PCT时间分辨免疫层析试纸条的研制:Eu-np活化后分别与鸡IgY和PCT捕获抗体MJG03相偶联得到Eu-np-鸡IgY和Eu-np-MJG03复合物,复合物按各自比例稀释后喷到结合垫干燥。NC膜用稀释的PCT检测抗体MJG05包被两条T线,用羊抗鸡IgY包被一条C线,然后37℃干燥。组装完成后,血清样品用样品稀释液作等体积稀释后加到加样孔,反应15min后用便携式荧光仪检测,得到（T1+T2）/C比值,根据在荧光仪中设置好的标准曲线,直接得到PCT浓度。2.PCT时间分辨免疫层析试纸条的优化及初步应用:PCT试纸条从T线划膜浓度、结合垫喷膜浓度和检测时间3个方面优化,从线性、灵敏度、精密度、特异性、回收率、临床标本比对6个方面进行性能评估。3.IL-6时间分辨免疫层析试纸条的研制:Eu-np活化后分别与鸡IgY和IL-6捕获抗体MIS02相偶联得到Eu-np-鸡IgY和Eu-np-MIS02复合物,复合物按各自比例稀释后喷到结合垫干燥。NC膜用稀释的IL-6检测抗体MIS01包被作为T线,用羊抗鸡IgY包被一条C线,然后37℃干燥。组装完成后,血清样品直接加到加样孔,反应15min后用便携式荧光仪检测,得到T/C比值,根据在荧光仪中设置好的标准曲线,直接得到IL-6浓度。4.IL-6时间分辨免疫层析试纸条的优化及初步应用:IL-6试纸条从检测时间进行优化,从平行测试、线性、灵敏度、回收率、精密度、特异性、临床标本比对7个方面进行性能评估。结果1.本PCT检测方法线性良好,线性范围为0.05100ng/mL,灵敏度为0.03ng/mL,与CRP、IL-6、IL-8、TNF-ɑ和RA无交叉反应,批内精密度变异系数（coefficient of variation,CV）和批间精密度CV分别为1.39%5.42%和2.00%6.86,回收率介于95%至101%之间,与AE-180全自动化学发光免疫分析仪作回归分析,结果一致性较好:y=0.9011x+0.4137（n=95,r=0.9936,p<0.01）,阳性符合率96.61%,阴性符合率94.44%,假阳性率5.56%,假阴性率3.39%和诊断符合率95.53%。2.本IL-6检测方法线性良好,线性范围为2500 pg/mL,灵敏度为0.37 pg/mL,与PCT、IL-8和CRP无交叉反应,批内精密度CV和批间精密度CV分别为5.92%8.87%和7.59%9.04%,回收率介于102%至106%之间,与SEIMENS全自动化学发光免疫分析仪作回归分析,结果一致性较好:y=0.9502 x+6.1397（n=214,r=0.9757,p<0.01）。结论1.在不用NHS而单用EDC时成功活化铕纳米微球,可减少操作步骤和节约试剂。2.PCT检测和IL-6检测快速,仅加样15 min后便可得到检测结果,优于1 h左右出结果的CLIA和5 h左右出结果的ELISA。3.PCT检测是仅需要50μL血清和50μL样品稀释液混匀后加样,待反应完成便可检测;IL-6检测仅需血清70μL,待反应完成便可检测。两种检测方法均为两步法,操作简便,标本用量少。4.检测仪器便宜小型、占地面积小,非专业人员也可操作,节约试剂,适于基层医疗机构推广使用。5.PCT免疫层析试纸条双T线捕获PCT抗原的能力更强,有助于提高了灵敏度和线性;在0.05100 ng/mL范围内线性范围良好（Y=0.0747X+0.5246,R2=0.9904）,灵敏度为0.03 ng/ml,批内精密度CV≤8.76%,批间精密度CV≤6.86%,特异性良好,与AE-180全自动化学发光免疫分析仪相关性良好（Y=0.9011X+0.4137,R2=0.9873,p<0.01）,符合临床检测要求。6.IL-6免疫层析试纸条在2500 pg/mL范围内线性良好（Y=0.0020 X+0.0051,R2=0.9988）,灵敏度为0.37 pg/mL,批内精密度CV≤8.87%,批间精密度CV≤9.04%,特异性良好,与SIEMENS IMMULITE 1000全自动化学发光免疫分析仪相关性良好（Y=0.9502X+6.1397,R2=0.9517,p<0.01）,符合临床检测要求。
王羽[8]（2019）在《细胞因子辅助免疫的抗体制备与应用及基于亲和力的免疫检测灵敏度研究》文中研究表明抗体作为免疫检测技术开发的关键原料,其质量直接决定了相应免疫检测方法的性能。对于一些免疫原性低,甚至不具备免疫原性的目标检测物,传统的免疫方式较难以获得高质量的目标抗体。同时在免疫检测过程中,抗原与抗体间的亲和力对所建立的检测方法灵敏度的影响也是不可忽视的。因此,开发高质量检测抗体及明确抗原与抗体间的亲和力对免疫检测方法灵敏度的影响十分有意义。本研究通过应用细胞因子作为分子佐剂辅助免疫制备单克隆抗体,在DNA免疫和皮下免疫两种免疫策略中证实了细胞因子作为分子佐剂对制备单克隆抗体的积极效果。进一步分析了高亲和力抗体所识别的具体抗原表位信息,以及抗原表位氨基酸对抗原-抗体免疫反应亲和力的影响,明确了亲和力在抗原与抗体结合与解离反应过程中的重要作用。通过分析系列与检测抗体具有不同亲和力的竞争抗原对竞争法免疫检测灵敏度的影响,明确了竞争抗原与检测抗体的亲和力和样本中待检抗原与检测抗体的亲和力差异对竞争法免疫检测灵敏度的影响。最后,应用制备得到的高亲和力单克隆抗体开发了抗缪勒氏管激素（Anti-mullerian hormone,AMH）及和肽素（Copeptin,CPP）全自动化学发光检测试剂（Chemiluminescence immuneassay,CLIA）,试剂具有优异的使用性能,并可用于临床样本的检测。主要研究结果如下:（1）通过将合成得到的mFlt3L、mGM-CSF、mCCL20基因片段连接到载体pCAGGS上,成功构建重组载体pCAGGS-mFlt3L,pCAGGS-mGM-CSF及pCAGGS-mCCL20。并验证了其可在293F细胞中有效表达目标蛋白,表明可作为分子佐剂进一步实验。（2）利用分子佐剂（mFlt3L、mGM-CSF、mCCL20）辅助DNA免疫的策略成功制备了针对AMH的高亲和力抗体,使用KD值小于4 nM的两株高亲和力单克隆抗体成功构建了AMH化学发光检测方法。该分析方法对AMH检测表现出高度敏感性和特异性。检测范围为0.12520 ng mL-1,检出限为0.099 ng mL-1。孵育时间仅需30 min,而商品ELISA试剂盒需3 h。用于临床血清标本中AMH的检测,结果与标准AMH检测ELISA试剂盒具有高度一致性。（3）通过分子佐剂（mFlt3L、mGM-CSF、mCCL20）辅助皮下免疫后,杂交瘤的阳性率明显提高,且经过一次杂交瘤制备、亚克隆筛选便得到8株稳定分泌抗体的细胞株,对比皮下普免两次杂交瘤制备得到4株的得率,此策略明显提高抗体的开发效率。经过纯度和效价检测,所制备的抗体纯度均可达到90%,效价均大于1:105;经过细胞免疫化学实验确认,所制备的抗体可与天然的和肽素发生特异性反应,具备免疫检测试剂开发的要求。通过亲和力表征对比,发现分子佐剂辅助免疫制备的抗体亲和力远高于皮下普免制备的抗体,最高亲和力抗体的KD值可达10-1010 M。（4）经过生物信息学软件分析及肽扫描,最终确定了4株高亲和抗体的表位序列,均位于152161（APEPFEPAQP）。经过丙氨酸突变扫描和分子动力学分析,发现4株抗体的表位关键氨基酸主要为脯氨酸（P）、苯丙氨酸（F）和谷氨酰胺（Q）。最终明确抗原氨基酸序列中含疏水氨基酸较多的位置容易形成抗原表位。（5）通过在免疫层析和间接竞争ELISA检测体系同时研究竞争抗原与检测抗体间的亲和力变化对检测体系灵敏度的影响,发现适度下调竞争抗原与抗体的亲和力后,检测限（Limit of detection,LOD）显着下降,在免疫层析体系中最高下降至原LOD的9.5%,在间接竞争ELISA体系中最高下降至原LOD的12.1%,最佳灵敏度改善效果LOD低至0.09 nmol L-1。表明适度的降低竞争抗原与检测抗体之间的亲和力可以改善竞争免疫检测方法学的灵敏度。（6）选用抗CPP高亲和力抗体作为捕获抗体,磁珠作为固相载体,成功构建了可用于CPP检测的全自动CLIA,检测范围1.21250 pmol L-1,且最低检出限LOD仅为6.25 pmol L-1,完全满足临床应用需求(<18.9 pmol L-1)。再者,全自动CLIA的样本孵育时间仅为30 min,而对照ELISA则需要2 h以上。用于临床血清标本中的CPP检测,与市售CPP检测ELISA试剂盒相比,结果具有显着一致性。因此,所构建的全自动CLIA分析方法可以成功用于CPP的临床快速检测。
马振[9]（2018）在《环境中痕量溴系阻燃剂的新型免疫分析方法的研究》文中研究表明溴系阻燃剂（BFRs）是目前阻燃效率最高的有机阻燃剂之一,能够满足于多种阻燃产品的使用要求。多溴联苯醚（PBDEs）属于溴系阻燃剂的一种,因其阻燃效率高,热稳定性好而被广泛应用于聚合物的生产中。其中,2,4,4’-三溴联苯醚（BDE-28）与2,2’,4,4’-四溴联苯醚（BDE-47）均为检出率较高的PBDEs同系物,具有很强的生物毒性。四溴双酚A（TBBPA）是一种常用的工业溴系阻燃剂,常因高温或其他理化因子的影响而释放到环境介质中。目前,BFRs的检测方法以气相或液相色谱为主,这类色谱检测技术具有较高的稳定性和准确度,但其检测周期长,样品前处理过程复杂且仪器的维护费用昂贵。因此,建立高灵敏度、高通量、方便快捷的免疫分析方法检测痕量BFRs在环境监测研究领域具有重要的科学意义和应用价值。本论文分别以BDE-28、BDE-47和TBBPA三种检出率较高的BFRs作为研究对象,利用BDE-28、BDE-47和TBBPA人工抗原及多克隆抗体,建立了三种新型免疫分析方法,并分别应用于环境样品的检测。对于建立高灵敏度、快速便捷的免疫分析方法检测痕量BFRs具有一定的参考作用。具体研究结果分别如下:（1）本研究首先设计合成了含氨基活性官能团的BDE-28半抗原,并分别利用傅里叶变换红外光谱、核磁共振氢谱和紫外-可见吸收光谱进行表征,验证BDE-28半抗原的分子结构,然后分别采用不同的方法将BDE-28半抗原与牛血清白蛋白（BSA）及卵清白蛋白（OVA）偶联,制备BDE-28人工免疫原及包被原。最后,以新西兰大白兔为免疫对象,利用BDE-28人工免疫原连续数次的免疫,所制备的BDE-28多克隆抗体（pAb-BDE-28）特异性强,与BDE-28结构类似物的交叉反应率均小于10%。pAb-BDE-28的效价达到64000倍以上,且其亲和常数高达2.53×107 M-1,能够满足后续免疫分析实验的要求。（2）用生物素-N-羟基琥珀亚胺酯（BNHS）标记的羊抗兔IgG修饰金纳米颗粒（GNPs）,建立了检测TBBPA的基于功能化金纳米的间接竞争BA-ELISA方法（GNPs-BA-ELISA）。实验分别考察了不同试剂浓度及基质效应的影响。以TBBPA浓度的对数值为横坐标、以抑制率的检测值为纵坐标建立检测TBBPA的GNPs-BA-ELISA方法的标准曲线。在最优反应条件下,TBBPA浓度为0.009μg/L-3.126μg/L时,线性关系良好,线性方程:y=23.58logC0+68.33（R2=0.9879）,灵敏度IC50为0.167μg/L,检测下限为0.0034μg/L;加标样品回收率为89.22%-107.91%,变异系数为6.23%-11.73%。GNPs-BA-ELISA方法检测TBBPA的板内和板间变异系数均小于13%。所建立的GNPs-BA-ELISA方法检测PM2.5及农田土壤样品中TBBPA的结果与HPLC方法具有较好的相关性（R2=0.9887）。与BA-ELISA方法比较,GNPs-BA-ELISA方法的灵敏度提高了3-4倍。（3）利用BNHS标记的羊抗兔IgG修饰氧化石墨烯载体,制备功能化的氧化石墨烯载体,再以BNHS作为生物素衍生试剂标记DNA片段制备生物素化DNA,分别建立检测BDE-28、BDE-47的基于功能化氧化石墨烯的间接竞争BA-iPCR方法（GO-BA-iPCR）。实验优化了各检测试剂的浓度,并考察检测体系中不同基质条件的影响。以分析物浓度的对数值为横坐标,以PCR扩增结果的Ct值为纵坐标,分别建立了检测BDE-28、BDE-47的GO-BA-iPCR方法的标准曲线。最优反应条件下,BDE-28浓度为5 pg/L-50000 pg/L时,线性相关性较好,线性方程为Ct=0.32logC0+12.63（R2=0.9756）,检测下限为1.27pg/L,加标样品回收率为90.75%-107.74%,变异系数为3.65%-9.73%。BDE-47浓度为1 pg/L-10000 pg/L时,线性关系良好,线性方程为Ct=0.24logC0+14.05（R2=0.9839）,检测下限为0.72 pg/L,加标样品回收率为91.67%-109.06%,变异系数为3.82%-11.06%。GO-BA-iPCR方法检测BDE-28及BDE-47的板内和板间变异系数均小于13%。利用GO-BA-iPCR检测PM2.5样品中的BDE-28、BDE-47,与GC-MS检测结果具有较好的相关性（BDE-28:R2=0.9868,BDE-47:R2=0.9877）。（4）用人工多克隆抗体和条形码DNA修饰金纳米颗粒,制备抗体IgG-GNPs-条形码DNA复合物作为生物探针,分别建立检测BDE-28、BDE-47的基于金纳米生物探针的直接竞争免疫PCR方法（GNPs-iPCR）。实验优化了人工包被原-生物探针结合的浓度量比。以分析物浓度的对数值为横坐标,以PCR扩增结果结果的Ct值为纵坐标,分别建立了检测BDE-28、BDE-47的GNPs-iPCR方法的标准曲线。在最优反应条件下,BDE-28浓度为6 pg/L-60000pg/L时,线性相关性良好,线性方程为Ct=0.54logC0+10.92（R2=0.9881）,检测下限为1.67 pg/L,加标样品的回收率为89.60%-109.91%,变异系数为4.25%-11.71%;BDE-47浓度为5 pg/L-50000 pg/L时,线性相关性良好,线性方程为Ct=0.43logC0+12.57（R2=0.9865）,检测下限为1.32 pg/L,加标样品的回收率为87.97%-107.90%,变异系数为3.70%-11.22%。GNPs-iPCR方法检测BDE-28及BDE-47的板内和板间变异系数均小于10%。GNPs-iPCR方法的灵敏度与GO-BA-iPCR接近,但其检测周期短,重复性更好,准确度更高。利用GNPs-iPCR检测不同环境介质样品中(PM2.5、沉积物及农田土壤)的BDE-28、BDE-47,与GC-MS的检测结果具有较好的相关性（BDE-28:R2=0.9879,BDE-47:R2=0.9897）。本文所建立的三种新型免疫分析方法中,环境样品在正常萃取后不需要预浓缩甚至纯化过程,近百个样品均可以在8 h内完成检测,检测水平达到了ng/L或pg/L的级别。所建立的GNPs-BA-ELISA、GO-BA-iPCR、GNPs-iPCR方法灵敏度高、稳定性好、方便快捷,分析物的检测值与HPLC、GC-MS结果具有较好的相关性,可完成不同环境介质中痕量BFRs的快速高通量检测。
吴瑞丽[10]（2018）在《基于CdSe/ZnS荧光量子点的侧向免疫层析定量检测技术的研究》文中进行了进一步梳理侧向免疫层析检测技术作为现场即时检测（POCT）领域非常重要且占比重最大的一项检测技术,由于其检测快速、操作方便、成本低廉等优势,被认为是发展中国家非常具有前景且节约成本的即时诊断技术。但传统的侧向免疫层析技术常用胶体金、有机荧光染料作为标记材料,其检测性能相对实验室检验方法存在着灵敏度较低、稳定性较差等问题。而荧光量子点作为一种新颖的半导体纳米材料,具有传统荧光染料无可比拟的光学性质（如宽激发窄发射,发射光谱可调,光化学稳定性好,荧光强度高,寿命长,单激发多元发射等优点）,其作为一种荧光标记物现已广泛应用于免疫诊断、生物传感、细胞标记、活体成像、光动力治疗等生物医学领域。将高质量的荧光量子点与侧向免疫层析技术结合,可实现对细菌、病毒蛋白大分子以及抗原小分子等的快速灵敏定量检测,促进量子点材料在生物医学领域中的广泛应用。本论文尝试采用不同方法修饰的（聚合物修饰和二氧化硅包覆修饰）荧光量子点（CdSe/ZnS,发射峰位为635 nm）为标记材料,通过优化量子点-抗体蛋白的偶联条件、侧向免疫层析体系的组成,分别采用双抗体夹心法和竞争法两种原理构建了基于量子点的侧向免疫层析（Lateral flow immunoassay）定量检测体系,实现了炎症标志物C-反应蛋白（CRP）、降钙素原（PCT）和黄曲霉毒素B1（AFB1）的快速定量检测,并初步尝试了建立了C反应蛋白和降钙素原同时定量检测的侧向免疫层析方法。主要研究内容和结果如下:1.基于聚合物修饰的荧光量子点（QDs@PMAH）对C-反应蛋白（CRP）的侧向免疫层析定量检测。以QDs@PMAH作为CRP抗体的蛋白标记材料,优化量子点与CRP抗体的偶联条件,依据双抗体夹心法构建了CRP的侧向免疫层析体系,探讨了层析体系试纸条样品结合垫、硝酸纤维素膜、探针用量及其稀释液等影响试纸条性能的有关因素。在优化的检测体系下,建立的定量免疫层析检测体系在CRP浓度为0.51000 ng/mL范围内具有良好的线性回归,最低检出限为0.30 ng/mL。与其它CRP的即时检测方法相比,该方法表现出灵敏度高、检测时间短（仅需3 min）且检测范围宽的明显优势。该免疫层析方法的批内和批间差异均小于15%,回收率在95%110%以内,说明该方法的稳定性良好,其检测结果可靠准确。通过对135例临床样本的检测,该方法的检测结果与行业金标准罗氏胶乳C反应蛋白诊断试剂盒的检测结果相比具有较好的一致性。2.基于聚合物修饰（QDs@PMAH）和二氧化硅包覆修饰的荧光量子点（QDs@SiO2）对降钙素原（PCT）的侧向免疫层析定量检测。分别以QDs@PMAH和QDs@SiO2为PCT抗体的蛋白标记材料,采用双抗体夹心法的原理,通过对免疫层析体系的优化,建立了对炎症标志物PCT的定量检测方法。建立的PCT侧向免疫层析定量检测方法,灵敏度高,检测时间仅需要12 min,在血清样本中PCT初始浓度为0.1100 ng/mL范围内均具有良好的线性回归。两种检测体系的PCT样本（3倍稀释前）的最低检出限LOD分别为0.09 ng/mL（聚合物修饰的量子点检测体系）,0.03 ng/mL（二氧化硅包覆修饰的量子点体系）,与目前商用的胶体金即时检测方相比具有更高的灵敏度（二氧化硅包覆修饰的量子点体系提高了10倍以上）。相对稀释后的样本,理论LOD分别计算为0.03 ng/mL和0.01 ng/mL。同时以二氧化硅包覆修饰量子点为标记材料建立的检测方法,探针的使用量相对较少,免疫试剂抗体的使用也相对较少,在灵敏度提高的同时,免疫层析体系的稳定性也有了较大的提高（批内和批间差异小于10%）。通过对140例临床样本的检测,建立的检测方法与医院采用的行业金标准梅里埃的酶联免疫荧光法进行对照比较,检测结果具有较好的一致性。3.基于二氧化硅包覆修饰（QDs@SiO2）的荧光量子点对黄曲霉毒素B1（AFB1）的侧向免疫层析定量检测。通过选用更稳定的二氧化硅包覆修饰的水相量子点作为标记材料,采用竞争法的原理构建了对食品中小分子AFB1的免疫层析定量检测方法。检测体系在玉米样本中AFB1初始浓度为2.5100 ng/mL范围内具有良好的线性回归,对于实际检测样本的AFB1半数抑制浓度IC50为0.294 ng/mL。该方法对于玉米实际样本中AFB1的最低检出限LOD为0.796 ng/g,该灵敏度是国内行业标准胶体金快速定量检测方法的2.5倍,按照实际检测时的14倍稀释,该检测方法的理论LOD经计算为0.057ng/g。同时,该检测方法的稳定性好,准确度高,回收率在80%120%之间。此外,该检测方法中的样本提取简单,经一步提取后可滴加样品检测,检测时间仅需要15 min,非常适合于基层生产或检验部门用于食品或饲料中AFB1的现场即时定量检测。4.尝试建立了同时检测CRP和PCT的量子点侧向免疫层析方法。以同一荧光发峰位的QDs@SiO2分别标记CRP抗体和PCT抗体制备荧光探针,在一个荧光免疫侧向层析体系中,采用用双抗体夹心法检测PCT和竞争法检测CRP的原理,实现了两种炎症标志物的同时定量检测。结果表明用同一量子点标记也可以实现两个指标的同时检测,检测范围和最低检测限可以和单独检测的结果相媲美,但体系对CRP检测时的稳定性还有待提高。以上研究成果证明荧光量子点作为优异的标记材料,在基于双抗体夹心法和竞争法的侧向免疫层析检测中都具有可实现目标物的定量、灵敏、快速检测的优势。其中二氧化硅包覆修饰的量子点作为标记材料构建的检测体系,具有免疫试剂用量少、灵敏度更高、稳定性更好的特点。因此基于量子点的侧向免疫层析技术为构建新型体外快速检测方法提供了新思路,也将会为我国分级诊疗体系的发展提供有力的即时检测技术支撑。
二、全自动特种蛋白免疫分析仪缓冲液、稀释液的研制（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、全自动特种蛋白免疫分析仪缓冲液、稀释液的研制（论文提纲范文）
（1）转基因兔乳汁中重组吸血蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂的纯化、结构分析和药效研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第一部分 文献综述 |
| 1 血栓性疾病与溶栓药物的研究进展 |
| 1.1 血栓的概述及溶栓机理 |
| 1.2 去氨普酶(DSPA)研究进展 |
| 1.3 其它生物溶栓药物的研究进展 |
| 1.4 问题及展望 |
| 2 乳腺生物反应器研究进展 |
| 2.1 乳腺生物反应器简介 |
| 2.2 乳腺生物反应器优势 |
| 2.3 作为乳腺生物反应器的常用动物 |
| 2.4 乳腺生物反应器应用 |
| 2.5 问题与展望 |
| 3 蛋白质分离纯化研究进展 |
| 3.1 蛋白质分离纯化概述及其常用技术 |
| 3.2 乳腺生物反应器生产的重组蛋白的分离纯化 |
| 3.3 DSPA的分离纯化 |
| 3.4 问题与展望 |
| 参考文献 |
| 第二部分 研究内容 |
| 第一章 乳腺特异性表达rDSPA转基因兔的传代繁殖 |
| 1 材料 |
| 1.1 动物 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验试剂 |
| 1.4 常用试剂的配制 |
| 1.5 DSPA编码区设计 |
| 2 方法 |
| 2.1 rDSPA转基因兔传代扩群 |
| 2.2 rDSPA转基因兔乳中rDSPA体外活性检测 |
| 2.3 rDSPA转基因兔乳中rDSPA表达水平检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 rDSPA转基因兔传代扩群 |
| 3.2 rDSPA转基因兔后代测交 |
| 3.3 rDSPA转基因兔乳中rDSPA体外活性检测 |
| 3.4 rDSPA转基因兔乳中rDSPA表达水平检测 |
| 4 讨论 |
| 5 参考文献 |
| 第二章 原核表达去氨普酶(DSPA)基因载体的构建 |
| 1 材料 |
| 1.1 载体 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验试剂及耗材 |
| 1.4 常用试剂配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 DSPA功能基因的引物设计 |
| 2.2 PCR扩增pCL25/DSPA表达载体 |
| 2.3 PCR产物和表达载体双酶切 |
| 2.4 PCR产物和表达载体酶切产物纯化 |
| 2.5 DSPA与pET-28a表达载体连接 |
| 2.6 DSPA与pET-28a表达载体连接产物转化TOP10 |
| 2.7 菌落PCR鉴定 |
| 2.8 pET-28a/DSPA重组质粒提取 |
| 2.9 pET-28a/DSPA重组质粒转化Rosetta |
| 2.10 pET-28a/DSPA原核表达载体诱导DSPA蛋白表达 |
| 2.11 亲和层析柱纯化DSPA |
| 2.12 蛋白透析 |
| 2.13 浓缩及定量 |
| 3 结果 |
| 3.1 pCL25/DSPA表达载体的构建 |
| 3.2 pET-28a/DSPA原核表达载体诱导DSPA蛋白表达及可溶性鉴定 |
| 3.3 Ni-NTA Resin亲和层析柱纯化DSPA |
| 4 讨论 |
| 5 参考文献 |
| 第三章 rDSPA单克隆抗体制备及筛选 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物及免疫原 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验试剂及材料 |
| 1.4 常用试剂配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 小鼠免疫 |
| 2.2 小鼠血清检测 |
| 2.3 细胞融合 |
| 2.4 阳性杂交瘤细胞株的筛选 |
| 2.5 阳性杂交瘤细胞株的单克隆化 |
| 2.6 多羟基反应单克隆抗体(PR-mAb)的筛选 |
| 2.7 阳性杂交瘤细胞的扩大培养和冻存 |
| 2.8 rDSPA单克隆抗体(PR-mAb)的大量制备 |
| 3 结果 |
| 3.1 免疫小鼠血清检测 |
| 3.2 阳性杂交瘤细胞株的筛选 |
| 3.3 阳性杂交瘤细胞株的单克隆化鉴定结果 |
| 3.4 多羟基反应单克隆抗体(PR-mAb)的筛选 |
| 3.5 小鼠腹水抗体制备及腹水抗体ELISA检测 |
| 3.6 小鼠腹水抗体纯化及SDS-PAGE蛋白电泳检测 |
| 3.7 纯化抗体的ELISA检测 |
| 4 讨论 |
| 5 参考文献 |
| 第四章 转基因兔乳中rDSPA的纯化 |
| 1 材料 |
| 1.1 纯化原料 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验试剂及耗材 |
| 1.4 常用试剂配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 兔乳前处理 |
| 2.2 硫酸铵沉淀兔乳清蛋白 |
| 2.3 DSPA及兔乳清蛋白等电点预测 |
| 2.4 小鼠单抗与亲和介质的偶联 |
| 2.5 免疫亲和层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 2.6 强阳离子交换层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 2.7 苯甲醚亲和层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 2.8 赖氨酸亲和层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 2.9 活性蓝亲和层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 2.10 纯化产物脱盐 |
| 2.11 FAPA 法检测rDSPA |
| 2.12 SDS-PAGE检测rDSPA |
| 2.13 Western Blot检测rDSPA |
| 2.14 纯化产物纯度测试 |
| 2.15 纯化产物去除内毒素 |
| 2.16 纯化产物内毒素检测 |
| 2.17 rDSPA注射剂配制 |
| 3 结果 |
| 3.1 兔乳前处理 |
| 3.2 硫酸铵沉淀兔乳清蛋白 |
| 3.3 DSPA及兔乳清蛋白等电点预测 |
| 3.4 纯化小鼠单抗与亲和介质的偶联 |
| 3.5 免疫亲和层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 3.6 强阳离子交换层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 3.7 苯甲醚亲和层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 3.8 赖氨酸亲和层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 3.9 活性蓝亲和层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 3.10 转基因兔乳中rDSPA的最终纯化方案 |
| 3.11 纯化产物脱盐 |
| 3.12 纯化产物SDS-PAGE及Western Blot检测 |
| 3.13 纯化产物纯度测试 |
| 3.14 纯化产物去除内毒 |
| 3.15 纯化产物内毒素检测 |
| 3.16 DSPA注射剂配制 |
| 4 讨论 |
| 5 参考文献 |
| 第五章 乳腺特异性表达rDSPA纯化产物的结构和功能检测 |
| 1 材料 |
| 1.1 检测样品 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验试剂及耗材 |
| 2 方法 |
| 2.1 rDSPA转基因兔乳汁中rDSPA信号肽序列切割位点预测 |
| 2.2 蛋白质N端测序 |
| 2.3 蛋白质C端测序 |
| 2.4 相对分子量测序 |
| 2.5 纯化产物体蛋白三维结构模拟 |
| 2.6 纯化产物体外活性测试 |
| 3 结果 |
| 3.1 rDSPA转基因兔乳汁中rDSPA信号肽序列切割位点预测 |
| 3.2 蛋白质N端测序 |
| 3.3 蛋白质C端测序 |
| 3.4 相对分子量测序 |
| 3.5 纯化产物蛋白三维结构模拟 |
| 3.6 纯化产物体外活性测试 |
| 4 讨论 |
| 5 参考文 |
| 第六章 rDSPA体内外溶栓效果的初步评价 |
| 1 材料 |
| 1.1 检测样品 |
| 1.2 实验动物 |
| 1.3 实验仪器 |
| 1.4 实验试剂及耗材 |
| 1.5 常用试剂配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 体外血凝块溶解试验 |
| 2.2 角叉菜胶制备大鼠尾部血栓模型 |
| 2.3 体内溶栓试验 |
| 2.4 大鼠血浆rDSPA半衰期试验 |
| 2.5 数据统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 rDSPA体外血凝块溶解效果评价 |
| 3.2 大鼠尾部血栓模型制备结果 |
| 3.3 rDSPA对大鼠尾部血栓模型溶栓效果评价 |
| 3.4 大鼠血浆rDSPA半衰期评价 |
| 4 讨论 |
| 5 参考文献 |
| 全文结论 |
| 附录一 |
| 附录二 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（2）用于检测抗环瓜氨酸肽抗体的胶乳增强免疫比浊试剂的制备、表征及评价（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 抗环瓜氨酸肽抗体的临床诊断意义 |
| 1.1.1 类风湿关节炎 |
| 1.1.2 抗环瓜氨酸肽抗体的概述 |
| 1.1.3 抗环瓜氨酸肽抗体的研究概述 |
| 1.2 免疫分析检测技术 |
| 1.2.1 化学发光免疫分析法 |
| 1.2.2 酶联免疫法 |
| 1.2.3 胶体金免疫分析法 |
| 1.2.4 荧光免疫分析法 |
| 1.2.5 胶乳增强免疫比浊法 |
| 1.3 免疫胶乳表征方法 |
| 1.3.1 透射电子显微镜 |
| 1.3.2 动态光散射扫描 |
| 1.3.3 Zeta电位 |
| 1.4 本文研究内容及意义 |
| 1.4.1 研究内容 |
| 1.4.2 主要技术路线 |
| 1.4.3 研究意义 |
| 第二章 环瓜氨酸肽的设计与筛选 |
| 2.1 实验试剂与仪器 |
| 2.1.1 实验试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.1.3 主要试剂配置 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 环瓜氨酸肽序列的设计 |
| 2.2.2 间接酶联免疫法 |
| 2.2.3 实验步骤 |
| 2.2.4 血清稀释的倍数 |
| 2.2.5 环瓜氨酸肽种类的筛选 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 血清稀释的倍数优选 |
| 2.3.2 环瓜氨酸肽的筛选结果 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 环瓜氨酸肽与胶乳偶联的优化 |
| 3.1 实验试剂与仪器 |
| 3.1.1 实验试剂 |
| 3.1.2 主要仪器 |
| 3.1.3 主要试剂配制 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 全自动生化仪操作方法 |
| 3.2.2 环肽与微球偶联方法 |
| 3.2.3 制备胶乳的偶联条件筛选 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 微球粒径的筛选结果 |
| 3.3.2 环肽的筛选 |
| 3.3.3 环肽的用量优化结果 |
| 3.3.4 活化剂EDC用量优化结果 |
| 3.3.5 偶联缓冲体系的筛选结果 |
| 3.3.6 胶乳含量优化结果 |
| 3.3.7 检测波长优化结果 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 胶乳试剂的表征 |
| 4.1 实验试剂与仪器 |
| 4.1.1 实验试剂 |
| 4.1.2 实验仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 透射电镜分析 |
| 4.2.2 动态光散射分析 |
| 4.2.3 Zeta电位分析 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 透射电镜微观结果 |
| 4.3.2 动态光散射粒径分析结果 |
| 4.3.3 Zeta电位结果 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 免疫胶乳试剂盒的性能评价 |
| 5.1 实验试剂与仪器 |
| 5.1.1 实验试剂 |
| 5.1.2 实验仪器 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 标准曲线 |
| 5.2.2 试剂盒的空白吸光度值 |
| 5.2.3 检测范围 |
| 5.2.4 准确度 |
| 5.2.5 精密度 |
| 5.2.6 与成品试剂盒ELISA法测定结果比较 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 试剂标准曲线 |
| 5.3.2 试剂盒的空白吸光度值 |
| 5.3.3 试剂盒的线性范围 |
| 5.3.4 胶乳试剂的准确度 |
| 5.3.5 胶乳试剂的精密度 |
| 5.3.6 自制试剂与ELISA试剂盒测定结果比较 |
| 5.4 讨论 |
| 第六章 结论 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 创新 |
| 6.3 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 缩略词表 |
（3）骨代谢生物标志物定量免疫分析技术的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩写词对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 骨代谢生物标志物概述 |
| 1.2.1 骨钙素(BGP) |
| 1.2.2 甲状旁腺激素(PTH) |
| 1.2.3 总Ⅰ型胶原氨基端延长肽(P1NP) |
| 1.2.4 25-羟基维生素D(25-OH VD) |
| 1.3 国内外骨质疏松现状 |
| 1.4 骨代谢检测市场需求 |
| 1.5 骨代谢检测技术的现状 |
| 1.6 免疫学检测方法介绍 |
| 1.6.1 原材料制备 |
| 1.6.2 抗原抗体的标记 |
| 1.6.3 免疫学反应的常见的几种模式 |
| 1.6.4 免疫试剂信号的产生 |
| 1.6.5 化学发光简介 |
| 1.6.6 钩状效应(HOOK效应) |
| 1.6.7 磁珠简介 |
| 1.7 本项目免疫检测方法建立的难点 |
| 1.8 立题依据及意义 |
| 第二章 骨代谢免疫检测方法中生物原材料的制备 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料和方法 |
| 2.2.1 菌株和序列 |
| 2.2.2 试剂与耗材 |
| 2.2.3 主要培养基与溶液 |
| 2.2.4 实验方法 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 重组P1NPα1 链蛋白的表达与纯化 |
| 2.3.2 天然P1NP蛋白的纯化 |
| 2.3.3 天然P1NP蛋白的赋值 |
| 2.3.4 小鼠尾血中抗体的滴度评价 |
| 2.3.5 P1NP单克隆抗体的筛选 |
| 2.3.6 维生素D单克隆抗体的筛选 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 骨代谢全自动化学发光免疫检测方法的建立 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料和方法 |
| 3.2.1 主要试剂及材料 |
| 3.2.2 主要溶液 |
| 3.2.3 实验方法 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 骨钙素化学发光免疫检测方法开发 |
| 3.3.2 总Ⅰ型胶原氨基端延长肽化学发光免疫检测方法开发 |
| 3.3.3 25-羟基维生素D化学发光免疫检测方法开发 |
| 3.3.4 甲状腺旁激素化学发光免疫检测方法开发 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 骨代谢标志物在临床中的应用 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验材料和方法 |
| 4.2.1 样本来源 |
| 4.2.2 主要试剂 |
| 4.2.3 主要仪器 |
| 4.2.4 实验方法 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 骨钙素与临床疾病的关系 |
| 4.3.2 25-羟基维生素D与临床疾病的关系 |
| 4.3.3 P1NP在正常男性人群参考值的建立 |
| 4.3.4 骨代谢标志物与肺移植的关系 |
| 4.4 本章小结 |
| 主要结论与展望 |
| 论文创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录:作者在攻读博士期间获得的基金、发表的论文 |
| 附录:作者在攻读博士期间参与制定的企业产品技术要求 |
（4）基于智能手机的免疫传感方法的研究及其在体外诊断中的应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1 体外诊断技术简介 |
| 1.1 生化诊断技术 |
| 1.2 分子诊断技术 |
| 1.3 免疫学诊断技术 |
| 2 基于智能手机的生物传感方法 |
| 2.1 基于智能手机摄像头的传感方法 |
| 2.2 基于手机环境光传感器的传感方法 |
| 2.3 利用手机供电或无线传输的传感方法 |
| 3 本论文研究内容 |
| 第二章 基于智能手机的酶联免疫层析传感器的研发与应用 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要试剂与耗材与仪器 |
| 3 方法 |
| 3.1 层析装置的设计、打印及组装 |
| 3.2 结果阅读装置及光纤基板的设计、打印及组装 |
| 3.3 条件优化 |
| 3.4 ELICS检测CEA标准品 |
| 3.5 方法对照实验 |
| 3.6 检测CEA临床血清样本 |
| 4 结果 |
| 4.1 工作原理 |
| 4.2 ELICS系统表征 |
| 4.3 手机软件LUX METER |
| 4.4 最佳反应条件的确定 |
| 4.5 标准曲线的建立 |
| 4.6 胶体金免疫层析试纸条及ELISA检测CEA标准品对照 |
| 4.7 交叉反应实验 |
| 4.8 临床样本检测结果 |
| 4.9 传感器系统对不同手机的适应性 |
| 5 小结 |
| 第三章 基于智能手机的高通量光纤免疫传感系统的研究及在新冠诊断中的应用 |
| 1 前言 |
| 2 基于径蚀膜的高通量检测板 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法与结果 |
| 2.3 小结 |
| 3 基于光纤的手持式阅读仪 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 方法与结果 |
| 3.3 小结 |
| 4 基于智能手机的HFIS在检测SARS-CoV-2 IgG中的应用 |
| 4.1 材料 |
| 4.2 方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.4 小结 |
| 5 基于智能手机的HFIS在检测SARS-CoV-2 N蛋白中的应用 |
| 5.1 材料 |
| 5.2 方法 |
| 5.3 结果 |
| 5.4 小结 |
| 第四章 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间成果 |
| 附录 |
| 致谢 |
（5）ID-UPLC-MS/MS测定人血清总睾酮方法的建立及应用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、超高效液相色谱串联质谱测定人血清总睾酮方法的建立 |
| 1.1 材料和方法 |
| 1.1.1 仪器和设备 |
| 1.1.2 试剂 |
| 1.1.3 标本来源 |
| 1.1.4 常用试剂和溶液配制 |
| 1.1.5 色谱条件 |
| 1.1.6 质谱条件 |
| 1.1.7 样品前处理 |
| 1.1.8 精密度 |
| 1.1.9 准确度 |
| 1.1.10 灵敏度 |
| 1.1.11 特异性 |
| 1.1.12 线性范围 |
| 1.1.13 基质效应 |
| 1.1.14 提取效率 |
| 1.1.15 稳定性 |
| 1.1.16 数据处理与统计学分析 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 样品前处理 |
| 1.2.2 色谱特性 |
| 1.2.3 精密度 |
| 1.2.4 准确度 |
| 1.2.5 灵敏度 |
| 1.2.6 特异性 |
| 1.2.7 线性范围 |
| 1.2.8 基质效应 |
| 1.2.9 提取效率 |
| 1.2.10 稳定性 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 二、超高效液相色谱串联质谱测定人血清总睾酮方法的应用研究 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 仪器和设备 |
| 2.1.2 试剂 |
| 2.1.3 标本来源 |
| 2.1.4 常用试剂和溶液配制 |
| 2.1.5 人血清总睾酮检测方法结果一致性的评估 |
| 2.1.6 冰冻人血清总睾酮参考物质(工作校准品)的制备 |
| 2.1.7 数据处理与统计学分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 人血清总睾酮检测方法结果一致性的评估的结果 |
| 2.2.2 冰冻人血清总睾酮参考物质(工作校准品)的制备的结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 综述 类固醇激素定量检测方法的研究进展 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（6）固相时间分辨免疫荧光层析检测LH方法的建立与评价（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 免疫层析技术 |
| 1.2 时间分辨荧光免疫分析技术 |
| 1.2.1 镧系元素荧光的光谱特征 |
| 1.2.2 时间分辨荧光免疫分析的研究进展 |
| 1.2.3 时间分辨荧光免疫分析的优势及影响因素 |
| 1.3 时间分辨荧光免疫层析技术 |
| 1.4 研究计划 |
| 1.4.1 研究目标 |
| 1.4.2 主要研制技术路线 |
| 2 促黄体生成素(LH)抗体性能的研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验仪器、材料和试剂 |
| 2.3 实验中所用试剂配制 |
| 2.4 LH时间分辨免疫层析系统的建立 |
| 2.5 实验方法 |
| 2.5.1 不同抗体组合灵敏度的初步研究 |
| 2.5.2 不同抗体组合初步特异性研究 |
| 2.5.3 不同抗体组合临床血清线性初步研究 |
| 2.5.4 不同抗体组合标准品线性的初步研究 |
| 2.6 结果与讨论 |
| 2.6.1 不同抗体组合灵敏度的初步研究 |
| 2.6.2 不同抗体组合初步特异性研究 |
| 2.6.3 不同抗体组合临床血清线性初步研究 |
| 2.6.4 不同抗体组合标准品线性的初步研究 |
| 2.7 小结 |
| 3 荧光结合垫处理溶液及工艺优化研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 仪器、材料和试剂 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 免疫层析检试剂的制备及检测方法 |
| 3.3.2 表面活性剂性能比较 |
| 3.3.3 表面活性剂浓度的优化 |
| 3.3.4 荧光结合垫处理工艺研究 |
| 3.3.5 荧光结合垫的稳定性研究 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 表面活性剂性能比较 |
| 3.4.2 表面活性剂浓度的优化 |
| 3.4.3 荧光结合垫处理工艺研究 |
| 3.4.4 荧光结合垫的稳定性研究 |
| 3.5 小结 |
| 4 样品垫配方优化研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 仪器、材料和试剂 |
| 4.3 实验中所用试剂配制 |
| 4.4 实验方法 |
| 4.4.1 免疫层析检试剂的制备及检测方法 |
| 4.4.2 样品垫缓冲系统的筛选 |
| 4.4.3 样品垫表面活性剂的筛选 |
| 4.4.4 表面活性剂浓度的优化 |
| 4.5 结果与讨论 |
| 4.5.1 样品垫缓冲系统的优化 |
| 4.5.2 样品垫表面活性剂的筛选 |
| 4.5.3 表面活性剂浓度的优化 |
| 4.6 小结 |
| 5 抗体包被系统的优化研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 仪器、材料和试剂 |
| 5.2.1 实验中所用标准品 |
| 5.2.2 免疫层析检试剂的制备 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 硝酸纤维膜的筛选 |
| 5.3.2 最佳包被配方的确定 |
| 5.3.3 检测线和质控线的稳定性研究 |
| 5.4 结果与讨论 |
| 5.4.1 硝酸纤维膜的筛选 |
| 5.4.2 最佳包被配方的确定 |
| 5.4.3 检测线和质控线的稳定性研究 |
| 5.5 小结 |
| 6 反应模式的研究 |
| 6.1 实验方法 |
| 6.1.1 稀释比例的确定 |
| 6.1.2 读数时间的确定 |
| 6.1.3 加样量的确定 |
| 6.1.4 标准曲线的建立 |
| 6.2 结果与讨论 |
| 6.2.1 稀释比例的确定 |
| 6.2.2 反应时间的确定 |
| 6.2.3 加样量的确定 |
| 6.2.4 标准曲线的建立 |
| 6.3 小结 |
| 7 荧光免疫层析试纸条的性能研究及评价 |
| 7.1 实验方法 |
| 7.1.1 最低检出限 |
| 7.1.2 特异性 |
| 7.1.3 线性 |
| 7.1.4 准确度 |
| 7.1.5 精密度 |
| 7.1.6 稳定性 |
| 7.1.7 方法学对比 |
| 7.2 结果与讨论 |
| 7.2.1 最低检出限 |
| 7.2.2 特异性实验 |
| 7.2.3 线性 |
| 7.2.4 准确度 |
| 7.2.5 精密度 |
| 7.2.6 稳定性实验 |
| 7.2.7 方法学对比 |
| 8 总结和展望 |
| 8.1 总结 |
| 8.2 展望 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
（7）细菌感染标志物快速定量检测方法的建立及初步应用（论文提纲范文）
| 英文缩写索引 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 PCT时间分辨免疫层析法的建立及初步应用 |
| 2.1 实验仪器和试剂及耗材 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 结论 |
| 第三章 IL-6时间分辨免疫层析法的建立及初步应用 |
| 3.1 实验仪器和试剂 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 结论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述免疫层析技术的发展及应用研究 |
| 参考文献 |
| 硕士学位期间研究成果 |
| 学位论文自评表 |
| 致谢 |
（8）细胞因子辅助免疫的抗体制备与应用及基于亲和力的免疫检测灵敏度研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 主要符号表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 免疫检测技术相关研究 |
| 1.2.1 免疫荧光分析技术 |
| 1.2.2 免疫层析技术 |
| 1.2.3 酶联免疫吸附 |
| 1.2.4 电化学免疫分析 |
| 1.2.5 化学发光免疫分析技术 |
| 1.2.6 数字化单分子免疫分析技术 |
| 1.3 单克隆抗体制备技术 |
| 1.3.1 鼠单克隆抗体 |
| 1.3.2 嵌合抗体 |
| 1.3.3 噬菌体展示技术 |
| 1.3.4 基因工程小鼠制备完全人源化抗体技术 |
| 1.4 DNA免疫制备单克隆抗体技术 |
| 1.4.1 DNA免疫技术诱导宿主免疫反应的机制 |
| 1.4.2 DNA免疫制备单克隆抗体的优点 |
| 1.4.3 DNA免疫制备单克隆抗体的技术要点 |
| 1.5 免疫佐剂研究进展 |
| 1.5.1 免疫佐剂的作用机理 |
| 1.5.2 传统免疫佐剂 |
| 1.5.3 细胞因子免疫佐剂 |
| 1.6 抗原表位分析技术进展 |
| 1.6.1 生物信息学软件预测 |
| 1.6.2 肽扫描技术 |
| 1.6.3 氨基酸定点突变技术 |
| 1.6.4 噬菌体展示技术 |
| 1.7 和肽素临床研究 |
| 1.7.1 和肽素与心血管疾病 |
| 1.7.2 和肽素与糖尿病、肾病 |
| 1.7.3 和肽素与脓毒血症 |
| 1.7.4 和肽素与其他疾病 |
| 1.8 抗缪勒氏管激素临床研究 |
| 1.8.1 AMH与卵巢储备功能 |
| 1.8.2 AMH在预测卵巢反应性中的作用 |
| 1.8.3 AMH和妊娠结局 |
| 1.9 研究的目的、意义和内容 |
| 1.9.1 本研究的目的及意义 |
| 1.9.2 研究的内容 |
| 1.9.3 技术路线 |
| 第二章 细胞因子表达载体的构建及鉴定 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料与仪器 |
| 2.2.1 细胞株与载体质粒 |
| 2.2.2 仪器与设备 |
| 2.2.3 主要试剂 |
| 2.2.4 主要溶液配制 |
| 2.3 细胞因子重组质粒的构建 |
| 2.3.1 目的基因的合成与鉴定 |
| 2.3.2 重组质粒的构建及鉴定 |
| 2.3.3 重组质粒真核表达鉴定 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 酶切鉴定及测序 |
| 2.4.2 真核表达鉴定 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 细胞因子辅助DNA免疫制备抗缪勒氏管激素单克隆抗体及应用 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料与仪器 |
| 3.2.1 实验试剂 |
| 3.2.2 主要仪器设备 |
| 3.2.3 动物、抗原、细胞及血清样本 |
| 3.2.4 主要溶液配制 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 免疫策略 |
| 3.3.2 间接ELISA评价免疫效果 |
| 3.3.3 细胞融合 |
| 3.3.4 筛选及亚克隆 |
| 3.3.5 腹水制备及抗体亚类分析 |
| 3.3.6 腹水的效价检测及纯化 |
| 3.3.7 抗体的纯度和效价的测定 |
| 3.3.8 抗体亲和力测定 |
| 3.3.9 mAb-MPs及 AP-mAbs的制备 |
| 3.3.10 最佳抗体配对的筛选 |
| 3.3.11 全自动化学发光检测方法的建立 |
| 3.3.12 方法学优化和评价 |
| 3.3.13 统计分析 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 免疫效果评价 |
| 3.4.2 腹水中抗体亚型分析 |
| 3.4.3 腹水效价检测 |
| 3.4.4 纯化抗体SDS-PAGE分析 |
| 3.4.5 纯化抗体效价检测 |
| 3.4.6 纯化抗体亲和力表征 |
| 3.4.7 全自动化学发光分析方法的构建 |
| 3.4.8 全自动化学发光分析方法的评价 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 细胞因子辅助皮下免疫制备高亲和力抗和肽素单克隆抗体及表征 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料与仪器 |
| 4.2.1 实验试剂 |
| 4.2.2 主要仪器设备 |
| 4.2.3 动物、抗原及细胞 |
| 4.2.4 主要溶液配制 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 免疫策略 |
| 4.3.2 免疫效果评价 |
| 4.3.3 细胞融合、筛选及亚克隆 |
| 4.3.4 融合阳性率及稳定株数计算 |
| 4.3.5 腹水制备及抗体亚类分析 |
| 4.3.6 腹水抗体效价评价 |
| 4.3.7 腹水的纯化 |
| 4.3.8 抗体的纯度和效价的测定 |
| 4.3.9 免疫细胞化学鉴定 |
| 4.3.10 抗体亲和力表征及比较 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 免疫效果评价 |
| 4.4.2 腹水抗体亚型分析 |
| 4.4.3 腹水效价检测 |
| 4.4.4 纯化效果鉴定 |
| 4.4.5 抗体效价 |
| 4.4.6 特异性识别天然抗原鉴定 |
| 4.4.7 抗体亲和力检测及比较 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 抗原表位氨基酸对免疫反应亲和力的影响 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料与仪器 |
| 5.2.1 实验试剂 |
| 5.2.2 主要仪器设备 |
| 5.2.3 主要溶液配制 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 抗原表位生物信息学分析 |
| 5.3.2 间接ELISA初步表位定位 |
| 5.3.3 肽扫描精确定位抗原表位 |
| 5.3.4 间接ELISA分析表位氨基酸 |
| 5.3.5 动力学方法分析表位氨基酸 |
| 5.4 结果与分析 |
| 5.4.1 IEDB分析CPP表位结果 |
| 5.4.2 DNAStar分析CPP抗原表位结果 |
| 5.4.3 抗原表位初步定位结果 |
| 5.4.4 抗原表位精确扫描结果 |
| 5.4.5 肽突变体间接ELISA结果与分析 |
| 5.4.6 肽突变体与抗体反应动力学分析 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 竞争法免疫检测中竞争抗原与抗体的亲和力对检测灵敏度的影响 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 实验材料与仪器 |
| 6.2.1 主要试剂 |
| 6.2.2 主要仪器设备 |
| 6.2.3 主要溶液配液方法 |
| 6.3 实验方法 |
| 6.3.1 改造竞争抗原亲和力分析 |
| 6.3.2 免疫荧光微球的制备及表征 |
| 6.3.3 CPP竞争免疫荧光层析检测体系的构建 |
| 6.3.4 CPP间接竞争ELISA检测体系的构建 |
| 6.3.5 竞争抗原亲和力变化对灵敏度的影响分析 |
| 6.4 结果与分析 |
| 6.4.1 改造竞争抗原亲和力表征结果 |
| 6.4.2 免疫荧光微球的表征 |
| 6.4.3 荧光免疫层析检测卡的优化 |
| 6.4.4 免疫层析检测体系灵敏度改善效果评价 |
| 6.4.5 间接竞争ELISA检测体系的优化结果 |
| 6.4.6 间接ELISA检测体系灵敏度改善效果 |
| 6.5 小结 |
| 第七章 高灵敏全自动和肽素化学发光免疫检测法的构建 |
| 7.1 引言 |
| 7.2 实验材料与仪器 |
| 7.2.1 实验试剂 |
| 7.2.2 主要仪器设备 |
| 7.2.3 样本的采集与保存 |
| 7.3 实验方法 |
| 7.3.1 免疫磁珠及酶标抗体的制备 |
| 7.3.2 全自动化学发光检测方法的建立 |
| 7.3.3 分析方法学优化 |
| 7.3.4 统计分析 |
| 7.4 结果与分析 |
| 7.4.1 最佳抗体配对的优化 |
| 7.4.2 AP-mAbs和 mAb-MPs优化 |
| 7.4.3 基质缓冲液溶液的pH和孵育时间优化 |
| 7.4.4 标准校正曲线建立 |
| 7.4.5 精密度、准确性、稳定性分析 |
| 7.4.6 特异性分析 |
| 7.4.7 与商品ELISA试剂盒对比分析 |
| 7.5 小结 |
| 结论与展望 |
| 一、结论 |
| 二、创新点 |
| 三、展望与不足 |
| 参考文献 |
| 附录Ⅰ测序结果 |
| 攻读博士学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 附件 |
（9）环境中痕量溴系阻燃剂的新型免疫分析方法的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 溴系阻燃剂的概述 |
| 1.1.1 多溴联苯醚简介 |
| 1.1.2 2 ,4,4’-三溴联苯醚 |
| 1.1.3 2 ,2’,4,4’-四溴联苯醚 |
| 1.1.4 多溴联苯醚的污染状况 |
| 1.1.5 四溴双酚A简介 |
| 1.1.6 四溴双酚A的污染状况 |
| 1.2 BFRs的检测方法 |
| 1.2.1 多溴联苯醚的检测方法 |
| 1.2.2 四溴双酚A的检测方法 |
| 1.3 免疫分析技术 |
| 1.3.1 常用的免疫分析方法 |
| 1.3.2 实时荧光定量免疫PCR技术 |
| 1.4 研究目的及意义 |
| 1.5 研究内容与技术路线 |
| 1.5.1 研究内容 |
| 1.5.2 技术路线 |
| 第二章 2,4,4’-三溴联苯醚人工抗原、抗体的制备 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验仪器与试剂 |
| 2.2.1 实验仪器 |
| 2.2.2 实验试剂 |
| 2.2.3 实验试剂的配制 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 BDE-28 半抗原的制备及表征 |
| 2.3.2 BDE-28 人工全抗原的制备 |
| 2.3.3 BDE-28 抗原的鉴定与表征 |
| 2.3.4 BDE-28 抗原蛋白质浓度的测定 |
| 2.3.5 偶联物结合比的计算 |
| 2.3.6 BDE-28 多克隆抗体的制备 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 BDE-28 半抗原的红外光谱和核磁共振氢谱表征 |
| 2.4.2 BDE-28抗原的鉴定 |
| 2.4.3 BDE-28抗原的浓度与偶联比 |
| 2.4.4 抗血清效价的测定 |
| 2.4.5 BDE-28抗体的蛋白含量及效价 |
| 2.4.6 BDE-28抗体的特异性 |
| 2.4.7 BDE-28抗体的亲和性 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 间接竞争GNPs-BA-ELISA检测TBBPA方法的建立及应用 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验仪器与试剂 |
| 3.2.1 实验仪器 |
| 3.2.2 实验试剂 |
| 3.2.3 实验试剂的配制 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 生物素-羊抗兔IgG-GNPs复合物的制备 |
| 3.3.2 间接竞争GNPs-BA-ELISA方法的建立 |
| 3.3.3 反应条件的优化 |
| 3.3.4 GNPs-BA-ELISA方法标准曲线的建立 |
| 3.3.5 GNPs-BA-ELISA方法的重复性 |
| 3.3.6 环境样品的采集与预处理 |
| 3.3.7 TBBPA样品的检测 |
| 3.3.8 方法的回收率检测 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 GNPs和生物素-羊抗兔IgG-GNPs复合物的表征 |
| 3.4.2 反应条件的优化结果 |
| 3.4.3 GNPs-BA-ELISA方法的标准曲线 |
| 3.4.4 GNPs-BA-ELISA方法的重复性 |
| 3.4.5 环境样品中TBBPA的检测 |
| 3.4.6 方法的回收率 |
| 3.4.7 与BA-ELISA方法的比较 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 间接竞争GO-BA-iPCR检测PBDEs方法的建立及应用 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验仪器与试剂 |
| 4.2.1 实验仪器 |
| 4.2.2 实验试剂 |
| 4.2.3 实验试剂的配制 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 生物素化DNA |
| 4.3.2 功能化氧化石墨烯复合物的制备 |
| 4.3.3 间接竞争GO-BA-iPCR方法的建立 |
| 4.3.4 反应条件的优化 |
| 4.3.5 GO-BA-iPCR方法标准曲线的建立 |
| 4.3.6 GO-BA-iPCR方法的重复性 |
| 4.3.7 PM2.5样品预处理及检测 |
| 4.3.8 方法的回收率检测 |
| 4.4 结果与结论 |
| 4.4.1 GO和生物素-羊抗兔IgG-GO复合物的表征 |
| 4.4.2 反应条件的优化结果 |
| 4.4.3 GO-BA-iPCR方法的标准曲线 |
| 4.4.4 GO-BA-iPCR方法的重复性 |
| 4.4.5 PM2.5样品的检测 |
| 4.4.6 方法的回收率 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 直接竞争GNPs-iPCR检测PBDEs方法的建立及应用 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验仪器与试剂 |
| 5.2.1 实验仪器 |
| 5.2.2 实验试剂 |
| 5.2.3 实验试剂的配制 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 金纳米生物探针的制备 |
| 5.3.2 直接竞争GNPs-iPCR方法的建立 |
| 5.3.3 GNPs-iPCR方法标准曲线的建立 |
| 5.3.4 GNPs-iPCR方法的重复性 |
| 5.3.5 环境样品的预处理及检测 |
| 5.3.6 方法的回收率检测 |
| 5.4 结果与结论 |
| 5.4.1 生物探针的鉴定 |
| 5.4.2 生物探针的蛋白标记率 |
| 5.4.3 GNPs-iPCR方法的标准曲线 |
| 5.4.4 GNPs-iPCR方法的重复性 |
| 5.4.5 环境样品的检测 |
| 5.4.6 方法的回收率 |
| 5.4.7 几种免疫分析方法的比较 |
| 5.5 本章小结 |
| 第六章 结论与展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 创新性 |
| 6.3 展望 |
| 参考文献 |
| 缩略词 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间已发表或录用的文章 |
| 攻读博士学位期间申请的发明专利 |
（10）基于CdSe/ZnS荧光量子点的侧向免疫层析定量检测技术的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 侧向免疫层析法 |
| 1.2.1 侧向免疫层析技术(LFIA)原理及其分类 |
| 1.2.2 侧向免疫层析技术的标记材料 |
| 1.2.3 侧向免疫层析技术的发展方向 |
| 1.3 量子点简介 |
| 1.3.1 量子点的性质 |
| 1.3.2 量子点的表面修饰和功能化 |
| 1.4 量子点在生物医学领域中的应用 |
| 1.4.1 量子点在生物标记成像中的应用 |
| 1.4.2 量子点在生物传感器中的应用 |
| 1.4.3 量子点在免疫分析检测中的应用 |
| 1.5 研究意义、技术路线和主要内容 |
| 1.5.1 目前存在的问题 |
| 1.5.2 本论文的研究技术路线 |
| 1.5.3 本论文的具体研究内容 |
| 第二章 基于聚合物修饰的荧光量子点对C-反应蛋白的侧向免疫层析定量检测 |
| 2.1 引言 |
| 2.1.1 C-反应蛋白及其检测的意义 |
| 2.1.2 C-反应蛋白的检测方法 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 实验试剂与材料 |
| 2.2.2 主要实验仪器 |
| 2.3 实验内容 |
| 2.3.1 量子点与CRP抗体复合物的制备 |
| 2.3.2 荧光量子点侧向免疫层析夹心法定量检测CRP的原理 |
| 2.3.3 荧光量子点侧向免疫层析法定量检测CRP体系的优化 |
| 2.3.4 荧光量子点侧向免疫层析法定量检测CRP体系的性能测定 |
| 2.3.5 真实样本检测 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 量子点-m CRP1 探针制备条件的优化 |
| 2.4.2 荧光量子点侧向免疫层析法定量检测CRP体系的优化 |
| 2.4.3 基于聚合物修饰的量子点建立的CRP侧向免疫层析定量检测体系的性能 |
| 2.4.4 真实样本检测及与其它检测方法的比较 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 基于聚合物和二氧化硅包覆修饰的荧光量子点对降钙素原的侧向免疫层析定量检测 |
| 3.1 引言 |
| 3.1.1 降钙素原及其检测的意义 |
| 3.1.2 降钙素原的检测方法 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 实验材料和试剂 |
| 3.2.2 主要实验仪器 |
| 3.3 实验内容 |
| 3.3.1 PCT量子点荧光探针的制备 |
| 3.3.2 荧光量子点侧向免疫层析法定量检测PCT检测体系的优化 |
| 3.3.3 荧光量子点侧向免疫层析法定量检测PCT体系的性能 |
| 3.3.4 真实样本检测 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 PCT量子点荧光探针的制备 |
| 3.4.2 荧光量子点侧向免疫层析法定量检测PCT体系的优化 |
| 3.4.3 基于聚合物修饰和二氧化硅包覆修饰的量子点建立的PCT侧向免疫层析定量检测体系的性能 |
| 3.4.4 真实样本检测及与其它检测方法的比较 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 基于二氧化硅包覆修饰的荧光量子点对黄曲霉毒素B1的侧向免疫层析定量检测 |
| 4.1 引言 |
| 4.1.1 黄曲霉毒素B1 介绍 |
| 4.1.2 黄曲霉毒素B1 的检测技术 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 实验材料和试剂 |
| 4.2.2 主要实验仪器 |
| 4.3 实验内容 |
| 4.3.1 AFB1 量子点荧光探针的制备 |
| 4.3.2 荧光量子点侧向免疫层析竞争法定量检测AFB1 体系的优化 |
| 4.3.3 荧光量子点侧向免疫层析竞争法检测AFB1 检测体系的性能 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 样品提取方法及样本稀释液的确定 |
| 4.4.2 样品结合垫预处理液的优化 |
| 4.4.3 T线包被抗原及探针用量的确定 |
| 4.4.4 AFB1 定量检测的标准曲线和灵敏度 |
| 4.4.5 重复性(批内和批间差异) |
| 4.4.6 准确度(回收实验) |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 基于二氧化硅包覆修饰的荧光量子点对C反应蛋白和降钙素原的同时定量检测 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料 |
| 5.2.1 实验材料和试剂 |
| 5.2.2 主要实验仪器 |
| 5.3 实验内容 |
| 5.3.1 量子点荧光探针的制备 |
| 5.3.2 量子点荧光免疫层析同时检测CRP和 PCT的原理 |
| 5.4 结果与讨论 |
| 5.4.1 T线上包被抗原、抗体浓度以及探针用量的确定 |
| 5.4.2 CRP和 PCT同时定量检测的标准曲线的初步建立 |
| 5.4.3 同一种量子点作为标记材料实现同时检测的机理 |
| 5.5 本章小结 |
| 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
四、全自动特种蛋白免疫分析仪缓冲液、稀释液的研制（论文参考文献）
- [1]转基因兔乳汁中重组吸血蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂的纯化、结构分析和药效研究[D]. 张婷. 扬州大学, 2021
- [2]用于检测抗环瓜氨酸肽抗体的胶乳增强免疫比浊试剂的制备、表征及评价[D]. 郭江华. 浙江大学, 2021(01)
- [3]骨代谢生物标志物定量免疫分析技术的研究[D]. 韩霜. 江南大学, 2021(01)
- [4]基于智能手机的免疫传感方法的研究及其在体外诊断中的应用[D]. 吴泽. 南方医科大学, 2021
- [5]ID-UPLC-MS/MS测定人血清总睾酮方法的建立及应用[D]. 孙光. 天津医科大学, 2020(06)
- [6]固相时间分辨免疫荧光层析检测LH方法的建立与评价[D]. 朱红. 浙江大学, 2020(03)
- [7]细菌感染标志物快速定量检测方法的建立及初步应用[D]. 黄德智. 中国人民解放军陆军军医大学, 2019(03)
- [8]细胞因子辅助免疫的抗体制备与应用及基于亲和力的免疫检测灵敏度研究[D]. 王羽. 华南理工大学, 2019(06)
- [9]环境中痕量溴系阻燃剂的新型免疫分析方法的研究[D]. 马振. 上海交通大学, 2018
- [10]基于CdSe/ZnS荧光量子点的侧向免疫层析定量检测技术的研究[D]. 吴瑞丽. 河南大学, 2018(12)