论文摘要
第一部分骨髓间充质干细胞的分离、培养、鉴定目的：熟练掌握骨髓间充质干细胞的培养、鉴定方法，为后续实验打下基础。方法：用全骨髓培养法分离培养Wistar大鼠骨髓间充质干细胞（BMSC）,在体外培养并传代。用免疫组化法及流式细胞检测技术对第三代骨髓间充质干细胞进行鉴定，检测其细胞表面抗原CD34、CD44及CD90的表达，用MTT法检测骨髓间充质干细胞的增殖情况并绘制细胞生长曲线。结果：骨髓间充质干细胞体外培养后贴壁生长,胞浆含有较大的颗粒，核卵圆形，细胞呈多角形、梭形，有多个大小不一的突起，细胞分裂相多见，细胞生长曲线示细胞生长状态良好。免疫组化法及流式细胞仪对第三代基质干细胞（BMSC）鉴定结果为： CD44抗原表达阳性，CD90阳性率：95.5％，CD34阳性率：0.21％，符合实验要求。结论：骨髓间充质干细胞容易获取、来源充足、可以大量传代扩增，加入诱导液后细胞形态发生改变并可向软骨细胞分化，可作为软骨组织工程的种子细胞。第二部分GFP基因转染，干预诱导BMSCs向软骨细胞方向分化的实验研究目的：骨髓间充质干细胞（BMSC）利用绿色荧光蛋白（GFP）标记技术进行转染标记；探讨在体外不同的生长因子诱导下鼠骨髓间充质干细胞（BMSC）向成软骨细胞诱导分化的能力，建立适合软骨细胞诱导分化条件的培养基，为软骨组织工程种子细胞的研究提供理论实验依据。方法：取第三代BMSC用含BMP-2（骨形态发生蛋白-2）和IGF-Ⅰ（胰岛素样生长因子-Ⅰ）诱导因子的培养基在单层细胞培养模式下观察其向软骨细胞诱导分化的能力,实验分为GFP转染组,未转染组。GFP转染组又分为四组: BMP-2（100ng/ml）诱导组, IGF-Ⅰ（10ng/ml）诱导组,IGF-Ⅰ,BMP-2（100ng/ml,10ng/ml）联合诱导组,未加任何生长因子组．未转染组同样也分为四组：BMP-2诱导组, IGF-Ⅰ诱导组，IGF-Ⅰ和BMP-2联合诱导组，未加任何生长因子组。用免疫组化法及流式细胞检测技术对第三代骨髓间充质干细胞进行鉴定，检测CD34、CD44及CD90细胞表面抗原的表达，用MTT法检测BMSC的增殖情况并绘制细胞生长曲线，经过14天诱导,镜下观察细胞形态及荧光表达,用免疫组化法检查Ⅱ型胶原表达;用二甲基亚甲兰（DMB）比色法定量检测糖胺聚糖（GAG）的分泌，用阿利新蓝染色检查糖胺聚糖的表达。结果：1、各诱导组中阿利新蓝染色及Ⅱ型胶原免疫组化均成阳性表达，且IGF-Ⅰ,BMP-2联合诱导组糖胺聚糖（GAG）的分泌量高于同组中其它各组（P<0.05），但转染组与未转染组中IGF-Ⅰ,BMP-2联合诱导组糖胺聚糖（GAG）的分泌量没有显著性差异（P>0.05）。2、转染GFP组可在转染后24小时、1周、2周、3周、4周时在荧光显微镜下可表达绿色荧光，且GFP基因转染后对BMSC的增殖分化无显著性影响（P>0.05）结论：1、IGF-Ⅰ和BMP-2可诱导骨髓间充质干细胞（BMSC）向软骨细胞方向分化，且二者联合作用对BMSC向软骨细胞方向诱导分化有明显的促进作用。在DMEM培养基中加入IGF-Ⅰ和BMP-2可作为一种理想的软骨细胞诱导条件培养基。2、GFP基因的导入对骨髓间充质干细胞（BMSC）的活性和生物学特性无显著性影响，且绿色荧光可在细胞内长期表达。绿色荧光蛋白（GFP）标记技术转染标记骨髓间充质干细胞（BMSC）可作为一套细胞标记技术追踪研究骨髓间充质干细胞移植后在体内的生物学变化（如迁移定植、分布、增殖和分化等）。
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标签：骨髓间充质干细胞论文; 免疫细胞化学论文; 绿色荧光蛋白论文;