人尿酸盐转运子（hURAT1）与原发性高尿酸血症遗传易感性研究

论文摘要

目的:hURAT1是维持血尿酸水平的关键离子通道,是原发性高尿酸血症的重要侯选基因。本研究应用基因测序方法,通过病例-对照研究,寻找hURAT1基因SNP和突变位点,探讨发现的SNP和突变位点对原发性高尿酸血症遗传易感性的影响,以期发现原发性高尿酸血症的致病位点和易感单倍型。方法:选择原发性高尿酸血症病人227例,对照组341例。取所有研究对象外周抗凝血,提取基因组DNA。设计特异性引物,采用聚合酶链（PCR）反应方法分别扩增hURAT1基因启动子、10个外显子及外显子和内含子交界处,进行测序,应用Genestar软件寻找SNP及突变位点;应用haploview软件检验SNP Hardy-Weinberg平衡,确认研究对象选取的随机性及两两SNP位点之间的连锁关系;应用X2检验比较不同组别基因型及等位基因频率,确定与原发性高尿酸血症相关的SNP及突变位点:应用Phase软件进行单倍型分析,确定原发性高尿酸血症易感单倍型;应用Logistic回归分析和不同组别间生化指标的比较,确认原发性高尿酸血症的致病位点。结果:1.hURAT1基因序列分析结果通过对568例中国汉族人群hURAT1基因启动子、10个外显子及外显子和内含子交界处测序,共发现13个SNP位点。其中5个SNPS位于启动子区域,分别为-454A＞T,-434T＞C、-382C＞T、-87C＞T、+118G＞A:3个SNPS位于外显子区,分别为C258T,C426T,T1309C;5个SNPS位于外显子和内含子交界处,分别为+2,271A＞G;+2,277 C＞T;+2,278A＞G;+3,11 G＞A;-8,103G＞A。第三内含子+11 G＞A为国际首次发现.2.SNPS Hardy-Weinberg平衡检验及连锁分析13个SNPS基因型在568例研究对象中的分布均符合Hardy-Weinberg平衡（P＞0.01）,提示所有研究对象选取符合随机性原则.对13个SNPS行基因连锁分析,结果显示,-454A＞T、-434T＞C、-382C＞T、-87C＞T、+118G＞A、C258T、C426T、+2,271A＞G、+2,277 C＞T和+2,+278A＞G高度连锁（D’＞0.8）,-8,103G＞A和T1309C完全连锁（D’=1）。但是第三内含子,+11G＞A不位于周围任何一个高度连锁的BLOCK中.在基因连锁图中呈现断开现象,提示第三内含子,+11G＞A可能是原发性高尿酸血症致病位点。3.基因型及等位基因频率比较对SNP组成的基因型及等位基因频率进行比较,结果显示,高尿酸血症患者中第三内含子,+11G＞A SNP,A等位基因频率为6.28%,在正常对照者中仅为1.7%,差异具有极显著性(P=5.94×10-5)。高尿酸血症患者突变基因型AG+AA频率显著高于正常对照组(12.11%VS 3.40%,P=8.21×10-5)。对上述13个SNP位点与原发性高尿酸血症相关性进行分析,结果显示,第三内含子,+11G＞A SNP位点与原发性高尿酸血症相关性最明显（等位基因OR=3.88;基因型OR=3.92）,-8,103G＞A和T1309C两个完全连锁的多态性位点也与高尿酸血症密切相关（OR=1.43）,启动子区5个高度连锁的SNP位点（-454A＞T、-434T＞C、-382C＞T、-87C＞T、+118G＞A）等位基因在两组的分布差异有显著性（P＜0.05）,但基因型分布差异无显著性。佘SNP位点与高尿酸血症相关性不明显。4.单倍型分析将在两组中分布有明显差异的8个SNP位点（-454A＞T,-434T＞C,-382C＞T,-87C＞T,+118G＞A,+3,11 G＞A、-8,103A＞G,T1309C）所组成的单倍型进行分析,结果显示,8个SNP位点共组成14种单倍型,其中有10种单倍型的频率在单组中＜2%,群体代表性差,因此被排除在统计之外。所选择的4种单倍型包含了98%以上研究人群的单倍型。单倍型Ht4（包含所有突变型等位基因）在高尿酸血症组中的频率显著高于正常对照组,与原发性高尿酸血症发病危险性密切相关(5.73%VS1.74%,OR=4.08,95%CI=1.95-8.55,P=5.93×10-5),余单倍型与正常对照组差异无显著性。由于单倍型Ht4是4种单倍型中唯一包含第三内含子+3,11 G＞ASNP A等位基因的单倍型,并是唯一与高尿酸血症密切相关的单倍型(P=5.93×10-5),因此,高度提示第三内含子+11 G＞A SNP与原发性高尿酸血症遗传易感性密切相关。5.Logistic回归分析及不同基因型生化特征为进一步确认原发性高尿酸血症的致病位点,对发现的hURAT1基因13个SNP位点进行Logistic回归分析。结果显示,如果固定SNP11（+3,11G＞A）,其它任何SNP位点都不能改变它的P值,相反SNP11（+3,11G＞A）可以改变其它任何一个SNP位点的P值,+3,11G＞A SNP A等位基因携带者血尿酸水平明显增高（等位基因A VS等位基因G:496.35±169.41 VS 418.87±134.77,P=0.005）,提示,+3,11G＞A SNP可能是原发性高尿酸血症的致病位点。结论:hURAT1基因多态性与原发性高尿酸血症遗传易感性密切相关。第三内含子+11,G＞A是原发性高尿酸血症的致病位点,Ht4单倍型是原发性高尿酸血症的易感单倍型。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 引言
• 材料和方法
• 1.1 实验仪器
• 1.2 实验试剂
• 1.3 实验方法
• 1.4 附表
• 结果
• 2.1 两组临床资料比较
• 2.2 hURAT1基因SNP筛查
• 2.3 SNPS位点Hardy-Weinberg平衡检验及连锁性分析
• 2.4 原发性高尿酸血症组与正常对照组等位基因和基因型频率分布
• 2.5 hURAT1基因单倍型分析
• 2.6 Logistic回归分析
• 2.7 hURAT1基因第3内含子多态性与高尿酸血症的相关性
• 2.8 附表、图
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述
• 综述的参考文献
• 攻读学位期间的研究成果
• 致谢