论文摘要
在地球这个大生态系统中存在着广泛的低温环境,如占地球表面14%的两极地区及海洋深处（90%的海水其平均温度为5℃或更低）等,存这些特殊的环境中生活着一类微生物即低温微生物。20世纪90年代以来,随着海洋生物技术的兴起,国内外学者相继从海冰中分离得到多种新的海洋极端微生物。利用基因重组技术,克隆极端酶的编码基因,并进行序列和结构分析,从而探讨极端酶的酶的学性质研究蛋白结构与功能的关系,是目前研究极端酶的主要方法之一。嘌呤核苷磷酸化酶（EC 2.4.2.1 purine nucleoside phosphorylase,简称PNP）是嘌呤核苷补救途径中的普遍存在的一种酶,广泛存在于哺乳动物、寄生虫和微生物中,催化如下可逆反应:嘌呤核苷+磷酸盐??嘌呤碱基+核糖-1-磷酸。在药物设计、核苷合成、分子进化和基因治疗上具有重要研究意义。本文首先研究了4个属的14株分离自北极海冰中的低温微生物的基本生长特性,并采用透明圈平板初筛的方法对其产酶的特性进行了研究,发现大部分菌株的最适生长温度在在15-20℃,多数菌株可在37℃下生长,但较为缓慢,生长需要有NaCl的弱碱性的环境,能够分泌多种胞外水解酶。属于适冷微生物。通过设计兼并引物PCR扩增得到了假交替单胞菌Pseudoalteromonas sp.Bsi590嘌呤核苷磷酸化酶（PiPNP）的全长基因,并对其序列进行了分析,该基因全长702bp,编码233个氨基酸残基,密码子分析发现存在6个稀有密码子,预测蛋白分子量为25,018.61,等电点为4.78。该基因与Pseudoalteromonas haloplanktisTAC125嘌呤核苷磷酸化酶基因相似性87.3%,蛋白相似性为93.6%。基因序列提交Genbank,登录号为EF222283。。根据对E.coli PNP（EcPNP）底物结合位点和酶催化活性中心的研究,EcPNP中与底物结合的氨基酸残基His4,Gly20,Arg24,Arg43,Arg89,Asp112,Leu158,Phe159,Met180,Glu181和形成催化部位的氨基酸残基Asp204在PiPNP中高度保守。对三种代表高温、中温和低温来源微生物中PNP氨基酸比较分析,发现高温菌中Met,Asp的含量（1.69,3.39）明显比中温菌（5.02,7.95）和低温菌（3.86,7.73）的低,PiPNP中同功能的Asp+Asn/Glu+Gln比例（0.67）高于中温（0.49）和高温PNP（0.54）。三种酶所含有的疏水性氨基酸比例一致（38%）。根据PNP系统进化树分析,同源三聚体PNP和同源六聚体分属在两个类群,不同底物催化特性的酶与按照蛋白晶体结构进行的分类一致,说明蛋白的结构决定催化专一性。来自大肠杆菌的两个PNP（PNP-Ⅰ和PNP-Ⅱ）亲源性低,分布在比较远。假交替单胞菌属的PNP没有形成种属特异性的分支,说明该基因在进化过程中十分保守,对新物种的形成不起决定作用。本文以X衍射获得的EcPNP蛋白三维空间结构为模板,将PiPNP的氨基酸序列进行同源模建,获得三维空间结构,两种蛋白的空间结构十分相似,均呈现αβ结构。为了研究适冷菌PiPNP的催化特性和温度稳定性,以及探讨与EcPNP的结构和功能关系,本文克隆了大肠杆菌PNP基因,利用pET表达系统构建了N段含有6-His-Tag的PiPNP和EcPNP重组质粒,经过一步快速亲和纯化得到活性蛋白。根据黄嘌呤氧化酶能将肌苷进行磷酸化反应生成的次黄嘌呤转变成尿酸,在293 nm有最大吸收峰的原理,建立了PNP酶活力测定的方法,对PiPNP和EcPNP的结构和功能进行了研究。比较PiPNP和EcPNP的CD分析,发现PiPNP具有较低的α-helix,较高的β-turn,PiPNP结构较松散,尿素和SDS可使PiPNP蛋白的二级结构发生迅速改变。温度微扰实验发现PiPNP和EcPNP在一段很窄的温度变化下结构迅速改变,它们的温度转变点是58℃和62℃,PiPNP的热稳定性比EcPNP低。比较不同肌苷浓度对酶最适催化温度发现,催化低浓度肌苷PiPNP最适温度30-35℃,EcPNP最适温度50℃,催化高浓度肌甘PiPNP最适温度50-60℃,EcPNP最适温度60-70℃,底物浓度对PiPNP最适酶活温度影响较大。温度稳定性研究发现PiPNP保温30min,酶的活性在37-42℃时发生急剧变化,50℃完全失活,EcPNP酶在50-55℃发生急剧变化,65℃时酶活性已完全丧失。将PiPNP放置在50 mM磷酸盐缓冲液中,能显著增加酶的稳定性,80℃放置30 min,剩余酶活38%。PiPNP和EcPNP动力学研究发现,磷酸盐浓度在0.1-5 mM变化时,PiPNP和EcPNP酶催化反应速度表现出非米氏方程特性,在1.2-5 mM之间PiPNP和EcPNP酶符合米氏方程线形双曲线特征,Km分别是0.21 mM和0.34 mM,最大催化反应速度分别为24.63 U/mg和10.04 U/mg。PiPNP和EcPNP不同温度下酶催化反应速度表现出高浓度肌坩抑制酶活的特性,PiPNP在37℃的Km是EcPNP两倍,催化效率比EcPNP高20%。PiPNP和EcPNP都能催化各种6-位替代的嘌呤核甘,具有广泛的底物专一性,PiPNP的最适催化底物为肌苷,PiPNP催化6-氧（鸟苷,肌苷）效率和EcPNP相近,但催化6-氨基嘌呤（腺苷）和6-甲基嘌呤的效率比EcPNP低,表明PiPNP和EcPNP在与底物结合的部位存在差异。
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