论文摘要
大脑的正常功能依赖于兴奋性和抑制性之间的稳态平衡。在海马中γ-氨基丁酸（GABA）能系统是最主要的抑制性系统,包含了相位性和紧张性两种抑制作用,在神经元和神经网络的正常功能中发挥了重要的作用。在某些疾病条件下,如脑缺血、癫痫、痛和脊髓损伤等,GABA能抑制的效能会显著降低,导致神经网络的脱抑制。另外,在一些神经退行性疾病如帕金森症和老年痴呆症,以及一些精神疾病如精神分裂、应激、毒品成瘾等疾病中,GABA能突触传递也会受损。因此,在很多神经疾病中,增加GABA能抑制是一个重要的治疗策略。实际上,目前已经有很多针对GABA能系统的药物开发。从另一个角度来看,很多广泛使用的药物也被发现可以调节GABA能系统。在我们的研究中,阿司匹林就是这样的一个药物。阿司匹林是目前最广泛使用的抗炎药物之一,水杨酸是阿司匹林在体内主要的代谢产物和有效成分。公认的水杨酸起效的机制是抑制环氧化酶COX的活性,进而抑制前列腺素的产生。近来的研究表明水杨酸也能通过调节离子通道或受体来影响神经元的功能。然而,水杨酸对于突触和神经网络功能的影响还不是很清楚。本研究中,我们观察了水杨酸对海马神经元兴奋性和突触传递的影响。通过海马脑片的电生理记录,我们发现水杨酸钠不影响基础的谷氨酸能突触传递,但可以通过抑制GABA能突触传递上调神经元的兴奋性。我们发现水杨酸钠在脑片上降低抑制性突触后电流（IPSC）的幅度,同时在培养的海马神经元上直接抑制GABAA受体（GABAAR）介导的反应。我们的结果表明阿司匹林作为广泛使用的药物,也可以通过调节GABA能系统影响海马突触功能和神经网络活动。考虑到水杨酸可以轻易穿过血脑屏障,我们的工作提示服用阿司匹林有可能在某些人群中引起神经网络的过度兴奋和不良反应。神经网络中,锥体神经元的功能输出取决于抑制性系统的时间和空间分布。在大多数研究中,大家更关注GABA能系统中突触前的GABA释放和突触后的GABAAR,正如我们前面水杨酸的工作中所关注的一样。对于GABA能系统中的另外一个成分,GABA的摄取则研究较少。1型GABA转运体（GAT-1）是神经元上的GABA转运体,负责了绝大多数的GABA摄取。在本研究中,我们利用GAT-1基因敲除小鼠研究了GABA摄取在突触可塑性和学习记忆行为中的作用。我们的结果表明在小鼠海马CA3—CA1谷氨酸能突触上,通过药理或基因敲除阻断GAT-1只特异的抑制了theta节律刺激（TBS）诱导的长时程增强（LTP）,而不影响高频刺激（HFS）诱导的LTP和低频刺激（LFS）诱导的长时程抑制（LTD）。在TBS的诱导过程中,当施加一个串刺激（由100 Hz的4个刺激脉冲组成）时,GABA大量释放,此时GAT-1的阻断会造成GABA的大量堆积从而剧烈的延长串刺激诱导的IPSC,增加了两串刺激间的GABA能抑制,从而抑制了下一串刺激诱导的效率。但是这种串刺激诱导的GABA能抑制的增加只是发生在一个有限的时间窗口内,只有在这个窗口内施加的下一串刺激的诱导效率会受到影响。根据这个时间窗,我们发现只有当多串刺激以theta频率（3-7 Hz）施加时,GAT-1的阻断才会抑制LTP的诱导。GABAAR的拮抗剂印防己毒素可以恢复GAT-1敲除小鼠上TBS-LTP的损伤,提示GABAAR介导了GAT-1阻断后GABA能抑制的增强。我们进一步发现GAT-1敲除小鼠表现出明显损伤的海马依赖的学习记忆能力,进一步的证明生理性的theta节律相关的LTP与学习记忆行为有更好的相关性。我们的这个研究表明GABA摄取可能是一种新的特异调节theta节律相关突触可塑性的机制。GABA转运体的阻断可以有效增加GABA能抑制。实际上,和GABAAR一样,GABA转运体已经是一些抗癫痫药物的靶点。噻加宾就是这样一个已经用于临床的GABA转运体阻断剂。我们上面的结果已经表明GAT-1介导的GABA摄取在TBS-LTP和学习记忆中的必要作用。那么一个重要的问题是噻加宾在临床使用时除了抗癫痫作用外是否会有损伤认知的副作用。我们发现50μM的噻加宾显著抑制大鼠海马的TBS-LTP,同时腹腔注射20 mg/kg的噻加宾会显著抑制大鼠海马依赖的学习记忆能力。这些结果表明大剂量的噻加宾可能有认知损伤的副作用。在海马中,除了GABAAR,越来越多的证据表明包含α2亚基的突触外甘氨酸受体（GlyR）的存在。但是,因为海马中没有甘氨酸能突触,海马GlyR功能的研究被极大的忽略了。在本研究中,我们发现阻断甘氨酸转运体GlyT1导致的胞外甘氨酸的增加可以通过激活GlyR降低海马神经网络兴奋性。在体实验也表明腹腔注射GlyT1的抑制剂可以缓解大鼠戊四氮诱导的癫痫发作。同时,我们发现GlyT1的阻断还能易化海马NMDAR依赖的LTP的诱导。我们推测,甘氨酸介导的NMDAR和GlyR的同时激活可能是一种稳态调节的机制。此外,与海马中表达胶质特异的GlyT1而不表达神经元特异的转运体GlyT2相一致,我们的结果支持海马中胶质细胞可能是甘氨酸的主要来源。首先,我们发现GlyT1阻断对于网络兴奋性的影响可以被胶质细胞抑制剂氟乙酸（FAC）所消除。其次,在神经胶质混合培养的神经元上可以记录到明显的GlyR介导的紧张性电流,而纯培养的神经元上记录不到明显的GlyR介导的紧张性电流。实际上我们sniffer的初步结果表明海马胶质细胞可以释放甘氨酸,并且这种释放可能是囊泡依赖性的,因为我们在培养的海马星型胶质细胞上看到了颗粒状的抑制性氨基酸囊泡转运体（VIAAT）的着色。这些结果还只是初步研究,还需要我们后面进一步深入的观察。综上所述,本研究集中在海马抑制性氨基酸GABA和甘氨酸对于神经网络兴奋性和突触可塑性的研究上。首先,我们证明海马GABA能系统是阿司匹林这个广泛使用的药物的中枢靶点之一。其次,我们证明了GAT-1介导的GABA摄取是theta节律相关可塑性和学习记忆中一种新的而且必要的机制。这个研究拓展了我们对于GABA能系统调节突触功能的了解。第三,我们发现GABA转运体的抑制剂噻加宾作为临床药物可能具有认知损伤的副作用。最后,我们初步研究了长期被忽视的海马甘氨酸以及甘氨酸受体。我们认为胶质来源的甘氨酸可能通过作用于GlyR和NMDAR介导了一种海马神经网络的稳态调节机制。
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