论文摘要
牙髓细胞是来源于神经嵴和间充质的多潜能细胞,主要由成牙本质细胞,成纤维细胞及未分化的间叶细胞组成,牙髓细胞是牙本质形成的关键。成牙本质细胞的增殖分化是牙胚发育和牙髓组织自我修复的关键。这一过程受多种基因和信号分子的调控。Dlx3为Dlx家族成员,位于17q21.33,在脊椎动物体内广泛表达,参与表皮及外胚层附属器官如腺体、牙齿、毛囊的发育。在牙齿发育过程中,Dlx3首先表达于牙源性上皮,在此成釉细胞分化为牙釉质,之后表达于牙源性上皮和间充质。之前的一些研究表明Dlx3参与成骨细胞的增殖分化,在软骨内骨化过程中,Dlx3在干骺端端的软骨区、分化中的成骨细胞、分化完成的成骨细胞中表达升高。在成骨细胞内高表达Dlx3,可以显著上调成骨细胞分化的标记物。成骨细胞和成牙本质细胞都来源于间充质细胞,具有相似的生物学行为,因此,我们推测Dlx3可能会在牙齿发育过程中影响牙髓细胞的增殖和分化。本课题研究的目的是观察Dlx3在调控牙髓细胞增殖及其向成牙本质细胞方向分化中的作用,探讨Dlx3在人牙髓细胞增殖的作用机制。本研究包含两个部分：第一部分：DI×3在人牙髓细胞增殖及其向成牙本质分化中的作用1DI×3在人牙髓细胞向成牙本质细胞分化过程中的表达从新鲜拔除的正畸前磨牙获取人牙髓细胞,矿化诱导液培养。Real-time、 Western blot检测矿化过程中转录因子Dlx3及矿化相关因子DSPP的表达情况。结果：在矿化诱导液的作用下,细胞内Dlx3表达量逐渐升高,Dlx3表达趋势与DSPP表达趋势一致。结论：Dlx3在牙髓细胞的表达随着分化程度而上升。2DI×3稳定感染细胞建立通过PCR扩增质粒获得Dlx3基因及启动子CMV,用HpaI、XhoI双酶切后将目的片段CMV+Dlx3连接到慢病毒载体pLL3.7质粒上,构建慢病毒表达质粒h-Dlx3-pLL3.7。h-Dlx3-pLL3.7或pLL3.7与psPAX2, pMD2.G起共同转染293FT获得病毒液,感染人牙髓细胞,得到稳定高表达Dlx3或pLL3.7的细胞hDPC/Dlx3、 hDPC/pLL3.7。hDPC/Dlx3可同时表达GFP和Dlx3。荧光显微镜和流式细胞仪观察感染效率,Real-time、Western blot检测hDPC/Dlx3组Dlx3表达情况。结果：荧光显微镜下观察GFP在0-14天都有较高的表达,流式细胞仪结果显示超过90%的细胞表达GFP. hDPC/Dlx3组Dlx3mRNA和蛋白的表达都较对照组hDPC/wt及hDPC/PLL3.7显著性升高。结论：成功构建了稳定表达Dlx3的细胞群。3DI×3对牙髓细胞增殖活性的影响迎过直接细胞计数和EdU检测Dlx3对人牙髓细胞增殖能力的影响。结果：直接细胞计数表明Dlx3感染的牙髓细胞增殖能力下降,而hDPC/wt、hDPC/pLL3.7两组增殖能力相似。EdU检测同样显示hDPC/Dlx3组EdU阳性细胞较对照组hDPC/wt、hDPC/pLL3.7,对照两纽EdU阳性细胞率无统计学差异。结论：Dlx3抑制牙髓细胞的增殖。4Dlx3对牙髓细胞分化的影响为了研究Dlx3在牙髓细胞向成牙本质细胞分化过程中的作用,我们检测了矿化结节形成,碱性磷酸酶活性,矿化相关基因DSPP、DMP1、ALP、Nestin及牙本质特异性蛋白DSP、DMP1的表达。结果：体外连续矿化诱导培养28天,Von Kossa染色后相差显微镜下观察矿化结节的形成发现hDPC/Dlx3组矿化结节数量和面积均大于hDPCs/pLL3.7、hDPCs/wt。碱性磷酸酶的活性也较对照组有显著升高。Real-time结果显示,矿化相关基因DSPP、DMP1、ALP、Nestin在第14天在hDPC/Dlx3组的表达均高于对照组,其中ALP表达提高最显著,较对照组高15倍,DSPP、DMP1、Nestin较对照组高1.9-3倍。DSP、DMP1蛋白在hDPC/Dlx3组的表达均高于对照组,与DSPP、DMP1mRNA表达一致。结论：Dlx3通过上调矿化相关基因促进牙髓细胞向成牙本质方向分化。第二部分：DIx3抑制牙髓细胞增殖的分子机制研究1DKK抑制牙髓细胞增殖由DKK1介导免疫荧光确定DKK1、Dlx3在人牙髓细胞中的表达,Real-time检测Dlx3高表达对DKK1mRNA的影响,使用DKK1siRNA抑制内源性DKK1表达后,观察是否可减弱Dlx3对牙髓细胞增殖的抑制作用。结果：Dlx3、DKK1都在人牙髓细胞中有表达,Dlx3高表达能促进DKK1基因的表达,同时下调Wnt/β-actin通路靶基因c-myc及clyclin D1的表达,siRNA沉默DKK1减弱Dlx3对牙髓细胞的增殖的抑制作用。结论：Dlx3抑制牙髓细胞增殖由DKK1介导。2DKK1基因启动子序列中DI×3结合位点的预测使用Genebank数据库查找人DKK1基因5’侧翼区-2000～+389区域DNA序列,手工检索Dlx3结合位点TAATT/AATTA,探测转录因子在基因调控区域的结合位点。然后通过构建含有不同长度DKK1基因启动子片段的重组报告质粒进行双荧光素酶检测,比较其活性变化从而确定转录调控区。结果：在DKK1启动子上游2000bp区域发现了12个Dlx3潜在结合位点。一系列荧光素酶表达载体瞬时转染293细胞后,分析这些表达载体荧光素酶表达活性发现DKK1的转录调控关键元件位于转录起始点上游-1656to-1245区域。结论：Dlx3对DKK1基因有启动活性。3DI×3与DKK1基因启动子结合的体内研究通过染色体免疫沉淀技术（CHIP）研究转录因子Dlx3在体内是否可以与DKK1基因启动子结合,用anti-Dlx3抗体沉淀染色体DNA,人IgG抗体做对照,PCR分析沉淀结果。结果：在体内,Dlx3可以结合到DKK1基因启动子上游1656bp至1245bp区域。结论：Dlx3在体内能够和DKK1基因启动子1656bp至1245bp区域结合。4DI×3对结合位点缺失型p1656载体的调控研究通过基因定点突变技术构建Dlx3结合位点缺失型p1656载体,研究DKK1基因启动子上Dlx3结合位点缺失后,Dlx3对DKK1转录活性的影响,以证实Dlx3确实是通过这些特定结合位点增强DKK1基因的转录活性。结果：突变Dlx3结合位点I或II对荧光素酶活性没有显著的影响,突变Ⅱ或Ⅲ显著降低荧光素酶活性。结论Dlx3通过D1x3II和Dlx3Ⅲ两个位点影响DKK1转录活性。