论文摘要
目的:探索丹参酮IIA对体外培养肝细胞株HL-7702的安全使用剂量并观察丹参酮IIA对肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factorα,TNFα）和过氧化氢（H2O2）所致体外培养肝细胞损伤的保护作用;同时探讨丹参酮IIA对活化肝星状细胞增殖的抑制作用。方法:1.选择体外培养人肝细胞株（HL-7702）作为研究对象,分别设立丹参酮IIA（1㎎/L、2㎎/L、4㎎/L、8㎎/L、10㎎/L、20㎎/L、40㎎/L）处理组和正常对照组（加入等量磷酸盐缓冲液（PBS））,通过MTT比色法检测肝细胞存活率。2.选择体外培养人肝细胞株（HL-7702）作为研究对象,分别设立丹参酮IIA（1㎎/L、2㎎/L、4㎎/L）处理组和正常对照组（加入等量PBS）,检测细胞培养上清液中ALT和LDH含量的变化。3.选择体外培养人肝细胞株（HL-7702）作为研究对象,分别设立TNFα（20ug/L）处理组、丹参酮IIA（2㎎/L）对照组、丹参酮IIA（2㎎/L）+TNFα（20ug/L）处理组和正常对照组（加入等量PBS）,通过MTT比色法检测肝细胞存活率,同时测定细胞培养上清液中的ALT和LDH含量。4.选择体外培养人肝细胞株（ HL-7702 ）作为研究对象,分别设立H2O2（7.5mmol/L、15mmol/L、30mmol/L、50mmol/L、100mmol/L）处理组、丹参酮IIA（2㎎/L）对照组、H2O2（7.5mmol/L、15mmol/L、30mmol/L、50mmol/L、100mmol/L）+丹参酮IIA（2㎎/L）处理组和正常对照组（加入等量PBS）,通过MTT比色法检测肝细胞存活率。5.选择体外培养大鼠活化肝星状细胞株（HSC-T6）作为研究对象,分别设立丹参酮IIA（12.5㎎/L、25㎎/L、50㎎/L、100㎎/L）处理组和正常对照组（加入等量PBS）,通过MTT比色法检测肝星状细胞存活率。结果:1.MTT法测定结果显示正常对照组吸光度（0.602±0.080）,丹参酮IIA处理组（丹参酮IIA1mg/L组: 0.599±0.028;丹参酮IIA2mg/L组: 0.594±0.082;丹参酮IIA4mg/L组: 0.576±0.064）与正常对照组相比（P>0.05）,说明丹参酮IIA在1-4㎎/L剂量范围内对肝细胞无毒性,为安全剂量范围;随着丹参酮IIA浓度的增高（8-40mg/L）显著抑制细胞增殖（丹参酮IIA8mg/L组: 0.563±0.113;丹参酮IIA10mg/L组: 0.554±0.014;丹参酮IIA20mg/L组: 0.526±0.010;丹参酮IIA40mg/L组: 0.492±0.013）,与正常对照组（0.602±0.080）相比（P<0.05）,且浓度越高,抑制作用越明显,存在剂量效应关系,说明超过剂量安全范围,则对细胞有毒性作用。2.赖氏法测定细胞培养上清液ALT和LDH含量,丹参酮IIA处理组ALT和LDH水平较正常对照组有所升高,其中丹参酮IIA1mg/L组（ALT: 54.14±6.85;LDH: 1183.88±412.06）,2mg/L组（ALT: 53.07±6.31;LDH: 1194.24±423.69）与正常对照组（ALT: 53.02±6.27;LDH: 1158.27±340.00）无统计学差异（P>0.05）;丹参酮IIA4mg/L组（ALT: 57.84±6.97;LDH: 1316.55±457.83）与正常对照组（ALT: 53.02±6.27;LDH: 1158.27±340.00）有统计学差异（P<0.05）。说明丹参酮IIA在1-2mg/L为安全剂量,4mg/L可疑为不安全剂量。3.MTT法测定结果显示TNFα（20ug/L）处理组（0.718±0.047）与丹参酮IIA（2㎎/L）+TNFα（20ug/L）处理组（0.821±0.034）相比肝细胞存活率下降（,P<0.05）;同时赖氏法测定细胞培养上清液ALT和LDH含量,TNFα（20ug/L）处理组与丹参酮IIA（2㎎/L）+TNFα（20ug/L）处理组相比（ALT: 53.02±5.48 vs 49.40±5.10;LDH: 1648.43±412.57 vs 1489.15±405.73, P<0.05）增高。4.MTT法测定结果显示H2O2（7.5-100mmol/L）处理组与正常对照组（0.796±0.066）相比,肝细胞存活率显著下降（H2O27.5mmol/L组: 0.521±0.043;H2O215mmol/L组: 0.449±0.020;H2O230mmol/L组: 0.349±0.018;H2O250mmol/L组: 0.330±0.054;H2O2100mmol/L组: 0.164±0.025, P<0.05）,且有一定的剂量依赖效应。同时,MTT法测定结果显示H2O2（7.5-15mmol/L）处理组与丹参酮IIA（2㎎/L）+ H2O2（7.5-15mmol/L）处理组相比,丹参酮IIA可以改善H2O2造成的肝细胞损伤（H2O27.5mmol/L组: 0.521±0.043 vs 0.593±0.024;H2O215mmol/L组: 0.449±0.020 vs 0.455±0.014, P<0.05）;H2O2（30-100mmol/L）处理组与丹参酮IIA（2㎎/L）+H2O2（30-100mmol/L）处理组相比,丹参酮IIA未改善H2O2造成的肝细胞损伤（H2O230mmol/L组: 0.349±0.018 vs 0.358±0.017;H2O250mmol/L组: 0.330±0.054 vs 0.344±0.031;H2O2100mmol/L组: 0.164±0.025 vs 0.178±0.024, P>0.05）。5.MTT法测定结果显示丹参酮IIA12.5mg/L处理组与正常对照组相比细胞活性无统计学差异（0.256±0.028 vs 0.258±0.029, P>0.05）,说明丹参酮IIA在此剂量对活化肝星状细胞无抑制作用;随着浓度的增高（25-100mg/L）,与正常对照组（0.258±0.029）相比,显著抑制细胞增殖（丹参酮IIA25mg/L组: 0.246±0.027;丹参酮IIA50mg/L组: 0.166±0.029;丹参酮IIA100mg/L组: 0.148±0.015, P<0.05）,且浓度越高,抑制作用越明显,存在剂量效应关系,说明在此剂量范围内,对细胞有明显抑制作用。结论:1.丹参酮IIA对体外培养肝细胞株（HL-7702）的安全使用剂量范围为1-2㎎/L。2.丹参酮IIA在安全剂量范围内能减轻TNFα（20ug/L）和H2O2（7.5-15mmol/L）所致体外培养肝细胞的损伤。3.丹参酮IIA在25-100㎎/L的剂量范围内可以有效抑制活化肝星状细胞的增殖。目的:探讨抗胰岛素样生长因子结合蛋白7（相关蛋白1）（IGFBP7/IGFBPrP1）抗体对活化的肝星状细胞增殖的抑制及凋亡的影响。方法:选择体外培养的大鼠活化肝星状细胞株（HSC-T6）作为研究对象,分别设立抗IGFBP7（rP1）抗体处理组（0.25mg/L、0.50mg/L、1.00mg/L）和正常对照组（加入等量PBS）,干预因素处理14h,采用MTT比色法检测抗IGFBP7（rP1）抗体对活化肝星状细胞增殖抑制的影响;同时在相同处理因素作用下流式细胞仪Annexin-Ⅴ/PI双染色法检测活化肝星状细胞凋亡发生率。结果:1.MTT结果显示:抗IGFBP7（rP1）抗体0.25mg/L组与正常对照组细胞活性无统计学差异,说明在此剂量对肝星状细胞无抑制作用;抗IGFBP7（rP1）抗体0.50mg/L组和抗IGFBP7（rP1）抗体1.00mg/L组,能显著抑制活化肝星状细胞的增殖,抑制率（抗IGFBP7（rP1）抗体0.50mg/L组: 12.30% ;抗IGFBP7（rP1）抗体1.0mg/L组: 26.90% , P<0.05）。2.流式细胞仪Annexin-Ⅴ/PI双染色法显示:与正常对照组相比,抗IGFBP7（rP1）抗体0.5mg/L组活化肝星状细胞凋亡发生率明显增加（20.25±1.41 vs 8.84±0.78, P<0.05）。结论:抗IGFBP7（rP1）抗体能抑制活化肝星状细胞的增殖并促进其凋亡,推测抗IGFBP7（rP1）抗体可能会作为一种新的抗肝纤维化治疗药物。
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